1、生物电镜技术1第一章 透射电子显微镜的原理与操作主讲：吴金浪一、电子显微镜的发展简史 20 世纪 30 年代，卢斯卡（E.ruska）发明了世界上第一台透射式电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)，并且成功地得到了一张由电子束作为光源形成的铜网放大像。当时放大倍数仅有 12 倍。 到 1934 年 电子显微镜的分辨率提高到 50nm，放大倍数达到 1 万倍。这就是电子显微镜的初型设计阶段。 1935 年电子显微镜基本定型。 1939 年德国西门子公司生产了世界上第一批作为商品的透射式电子显微镜，分辨率优于 10nm，放大倍数达到 10 万倍。 6
2、0 年代透射式电子显微镜的分辨率达到 0.5nm。 70 年代末电子显微镜的点分辨率已优于 0.3nm，晶格条纹分辨率达到 0.14nm。实现了人们早就向往的对原子像和晶格像的观察。 80 年代电子显微镜已发展成为一种综合分析仪器。例如，安装配有计算机系统的能量分析谱仪，对样品进行元素的成分分析。样品室内亦可装配加热、冷却、大角度倾斜、拉伸样品台等附件，使透射式电子显微镜既能观察样品的形态又能分析样品的成分。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM) 是显微镜世家中的一位后起之秀。自第一台定型的透射式电子显微镜产生后，法国卡诺尔就提出了扫描电子显微镜的设
3、计思想和工作原理。到 1942 年剑桥大学首次制成世界上第一台扫描电子显微镜。由于扫描电子显微镜使用范围广，并具备分辨率高、图像立体感强、放大倍率选择范围广、样品适应性大、制样方便等优点。所以后期发展速度比透射式电子显微镜快的多。70 年代已发展成为性能完善，自动化程度高，功能齐全的一种电子光学仪器。电子显微镜种类：由于电子与物质相互作用会产生透射电子、弹性散射电子、能量损失电子、二次电子、背反射电子、吸收电子、X 射线、俄歇电子、阴极发光和电动力等等。电镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定的。 主要分为透射式电子显微镜( 简称透射电镜，transmission elec
4、tron microscope，TEM)和扫描电子显微镜(简称扫描电镜， scanning electron microscope, SEM)两大类。 扫描透射电子显微镜(简称扫描透射电镜，STEM)则兼有两者的性能。为了进一步表征仪器的特点，有以加速电压区分的，如：超高压(1MV)和中等电压(200500kV)透射电镜、低电压(1kV)扫描电镜；有以电子枪类型区分的，如钨灯丝电镜、场发射电镜；有以用途区分的，如高分辨电镜，分析电镜、能量选择电镜、生物电镜、环境电镜、双束扫描电镜(FIB)等。有以激发的信息命名的，如电子探针 X 射线微区分析仪(简称电子探针，EPMA)等。二、透射电镜的基本原
5、理 生物电镜技术2就最基本的原理来说，透射电镜和光学显微镜是相同的，它们的显微放大过程基本相似，而且电镜的光路和部件术语也同光镜基本一样。不同的是，电镜的照明源不是可见光而是电子束；透镜也不是玻璃而是轴对称的电场或磁场，并且电子显微镜的总体结构、成像原理、操作方式等与光学显微镜有着本质上的区别。 透射电镜的基本原理如下：(一)分辨本领与放大倍数 分辨本领是指能够分辨物体上两点之间的最小距离。光学显微镜的分辨极限为O.2m，而电镜的分辨本领可优于 2 ，相差达 l 000 倍，因为影响光镜提高分辨本领的主要因素是由于光线的衍射作用。光学显微镜的分辨本领由阿贝公式决定：=0.612式中 d 为分辨
6、本领， 为照明波波长，n 为物体与物镜之间介质的折射率， 为物体上的点与物镜所成夹角的一半。普通光学显微镜用油浸镜头时 n1.5，90 。即 sin1，用可见光作照明源时，其平均波长约为 5 000 ，那么它的分辨本领约为 2 000 。这说明光学显微镜只能分辨大于 2 000 的结构。要提高分辨本领，必须采用波长短的照明源。电子显微镜的照明源波长约为 0.05 ，目前最好的电镜分辨本领已达 1.4 ，比光学显微镜提高了 1000 多倍。 放大倍数是指物体经过仪器放大后的像与物的大小之比。放大了的像还可多次放大，但到一定限度后继续放大时便不能增加细节，这是分辨本领的限制所致。不能增加图像细节的
7、放大倍数称为空放大，而与分辨本领相应的最高放大倍数称为有效放大倍数，为眼的分辨本领与仪器的分辨本领之比。生物电镜技术3目前商品电镜的分辨本领可达到 2 ，其有效放大倍数为My= =0.2210-7106（倍）即 100 万倍。这个倍数可以从电镜上直接得到，也可在摄制 20 万倍的底片后再以光学放大5 倍来获得。因此，标示电镜性能的主要指标是分辨本领而不是放大倍数。(二)电子束的产生电子束是电镜的照明介质。目前大多数电镜的电子束是由热阴极、控制极和阳极构成的三极式电子枪产生，其示意图： 阴极又称为灯丝 (包括钨丝、六铍化镧等) ，通常用钨丝制成，通电加热后灯丝内的自由电子热运动增加并逸出表面，在
8、加速电压作用下，阳极相对阴极形成正电场，逸出阴极的电子在正电场力作用下高速飞向阳极，中心部分的电子因惯性而穿过阳极孔成为照明电子束。 控制极靠近阴极表面，相对阴极加上数百伏的负电位，调节电位高低可以控制阴极发射电子的数目，亦即调节了电子束的强弱。钨阴极在使用时，由于金属蒸发和电子枪内残余气体的侵蚀，寿命一般为几十小时。(三)电子透镜及其作用运行中的电子束只有在通过电场或磁场时才能改变其运动轨迹。轴对称的电场或磁场生物电镜技术4可以使电子束聚焦，故称为电子透镜，前者叫静电透镜，后者叫磁透镜。一束电子的螺旋形轨迹是相似的。为便于理解，可设想将其外周包络起来而不考虑其有否旋转，则包络线的形状基本上和
9、光学玻璃会聚透镜的光路相似。实用的电磁透镜是在线圈外面套上铁壳作磁路，并在铁壳中心置有极靴(pole piece)，使线圈通电后产生的磁场高度集中而又均匀地分布在极靴中心。生物电镜技术5电磁透镜的焦距决定于磁场强度，磁场强度决定于通过线圈的电流强度。因此，可以调节激励电流来改变磁场强度，从而达到改变放大倍数和进行图像调焦的目的。由于电磁透镜像差小，调节容易，因此为现代电镜所普遍采用。但有些电子透镜不必改变焦距，可采用磁钢制造形成永久磁场，即为永磁透镜。 电子透镜的缺陷： 球差球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的会聚能力不同而造成的。结果在象平面成了一个满散圆斑。 象散磁场不对称时，就
10、出现象差。有的方向电子束的折射比别的方向强，这样，圆形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑。 色差电子的能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着电子能量而改变，因此，能量不同的电子束将沿不同的轨迹运动。产生的漫散圆斑还原到物平面。(四)反差与成像反差就是像与背景在亮度上的差别。在电镜中，当电子束中的电子碰到样品中的原子核时，电子轨道将偏斜一个角度，这种相互作用的过程称为弹性散射。弹性散射的强度与样品元素的原子序数成正比，原子序生物电镜技术6数愈高，对入射电子的散射能力就愈大。在物镜的后焦面上装一接地的光阑，散射角度大的电子被光阑截获而除去，仅让透射电子和散射角小的电子穿过光阑孔参与成像，从
11、而形成反差。这个光阑孔越小(通常为 2030m)。被截除的散射电子便越多，像的反差也就越好。 生物组织样品主要由原子序数很低的碳、氢、氧、氮等元素组成，在电镜中不能直接形成反差，因而不能成像。为了获得生物样品的反差，必须对样品进行电子染色，即在样品制备过程中使组织块或超薄切片与重金属盐类(如锇、铀、铅 )相作用，使组织中的某些结构结合 (化合、吸附)重金属元素，从而增加这些结构对电子的散射能力以获得反差，使样品显示出清晰的结构来。三、透射电镜的使用（一）快速检查合轴的方法合轴的好坏直接影响着电镜的性能，所以使用前有必要对电镜的合轴进行检查。快速检查合轴的步骤：1. 将光斑聚到最小，降低灯丝发射
12、电流，调出灯丝像，检查灯丝发射是否均匀。2.反复微量改变第二聚光镜激励电流，观查光斑是否出现椭圆形，以判断聚光镜是否有像散。3调物镜激励电流从最大到最小（允许使用者观察电镜时调焦用的最大钮） ，反复调整，观察光斑中心是否偏离荧光屏中心。如有偏离说明照明系统与成像系统合轴不佳。4放入样品聚好焦，找一标记移置荧光屏中心，然后向欠焦的方向（减小物镜激励电流的方向）调中聚焦钮 68 档，观察标记是否偏离荧光屏中心，如有偏离说明电流中心合轴不好。5选择样品上颗粒密集的地方，在高倍数下改变物镜激励电流，若图像出现方向性的结构，说明物镜有残存象散。上述五步的检查，基本上可以判断电镜合轴是否合格。（二）操作钮
13、(键)参量的选择及使用方法操作钮(键) 的参量是使用者根据样品、分析、记录等要求而定。1加速电压值的选择 在许多电镜中，高压分为 20kV、40kV 直到 100kV，或者更高。所生物电镜技术7以存在选择的问题。首先分析加速电压对电镜有关参量的影响。(1)加速电压越高，电子波长越短，分辨率增高。(2)加速电压越高，对于给定的一个样品，穿透能力越强，图像亮度提高。但振幅反差下降。(3)加速电压在 80100kV 时，透过样品的电子打在荧光屏上，荧光粉发光效应最佳。(4)80kv 的加速电压。对目前多数照像底片来讲，感光效率最好。综合上述情况，对于生物样品来讲，加速电压一般选择在 6080kV 间
14、较为合适。2放大倍数的选择(1)倍数越高，电子束流照射的样品范围越小，样品信息损失越多。(2)倍数越高，样品上所要求的照明强度越强。倍数增加两倍，样品上的照明强度必须增加 4 倍 。由此会增大样品上的辐射损伤。(3)倍数增大，样品及透镜本身的缺陷随之增大而突出。(4)高倍率的图像较低倍率聚焦、摄影难度大。3. 倍数的选择原则是： 放大倍数与所需要的分辨率相一致。 一般在满足分辨率的条件下，倍数尽可能选低些。 在实际操作中，为了减少样品受电子的照射时间，先在 200 以下的倍数内粗查样品全貌，选择最合适的观察部位后再提高倍数。 4聚焦 5 万倍以上的图像聚焦需要有较高的操作技能。 聚焦是通过调整
15、物镜激励电流实现的。聚焦的方法一般是从粗到细逐档调整。 近代高档次的商品电镜装有微控装置，使用者只须操作一个钮(键)便可自动聚焦。(1)低倍聚焦：一般 15000 倍以下的图像为低倍像。低倍像调正焦点，多使用图像摇摆器(wobbler) ，目前多数电镜装备此种装置。它有两组偏转线圈组成，在偏转线圈上通 50 周/秒的交流电，使用时照明束以样品平面上的一点为中心来回摆动。当物镜处于正焦点时，对于样品平面上的一点任意方向发射的电子到像平面还是一点当物镜处于过焦或欠焦时，则在像平面上散焦成两个点，图像呈现摆动。通过聚焦使图像稳定，此时即为正焦点。在 15000 倍以上的图像用摇摆器调焦效果不好。(2
16、)高倍聚焦：15000 倍以上的图像为高倍像。可采用最小反差法，操作方法是：拔出物镜光阑，调节聚焦钮，图像出现最小反差时即为正焦点，然后加入物镜光阑再进行观察分析。 其原理可用干涉理论来解释，因为样品中任何质量厚度迅速改变的区域周围都出现Fresnel 环，此环在欠焦时是亮线，过焦时是黑线，正焦时完全消失，所以正焦时像的反差最小。5光阑的选择(1)聚光镜光阑孔的选择：聚光镜光阑位于聚光镜下方。是一个多孔的可动光阑。一般三个孔，典型孔径为生物电镜技术8lOOm、200m、600m。根据需要选择适当的光阑孔，以改变孔径角。较薄的样品为了提高反差（位相反差）需要较小的光阑孔，使照明孔径角极小。使用较
17、小的聚光镜光阑孔，可减少薄样品上的辐射损伤。为兼顾诸方面的因素，实践中多采用200m的光阑孔。 (2)物镜光阑孔的选择：物镜可动光阑位于物镜上方，是一个四孔光阑，典型孔径为25m、50m、75m、100m 。选择物镜光阑孔径时，应考虑到样品的厚度。较厚的样品，散射电子角度大，反差较好，但亮度相对减小，所以应选用较大的孔径。较薄的样品为了提高反差选用较小的光阑孔。6样品的安装 安装样品是一件较容易的事，但并非是不重要的事。它的操作关系到图像的分辨率，为此安装样品时要求：手不能触摸进入真空系统的部分。以免手上的水分或脏物进入电子光学系统。放样品时要摆正放平，使载网与样品夹持器或样品杯接触良好，保证
18、有良好的热传导，防止样品热漂移。 7照像照像是记录观察者认为感兴趣的区域做为进一步分析或长期保存用。目前底片的分辨率高于荧光屏分辨率，所以底片可提供比荧光屏更多的样品信息。拍摄一张较满意的照片应注意以下步骤:(1)选择适当的倍数，使预拍照的区域充满荧光屏内照像的区域。(2)根据倍数和图像反差确定曝光时间和感光度。反差弱的图像可适当增加曝光时间。(3)图像无漂移，无振动，注意过底片时马达引起的振动。(4)确认焦点合适、反差适中。(5)注意室内光线不能对曝光有影响观察结束，应即时从真空中取出底片接收盒送暗室冲洗。8减少辐射损伤的方法：通常采用的方法是减少电子束发射电流及使用小的聚光镜光阑孔。注意：
19、 在减少聚光镜光阑孔时必须保证图像亮度。也可采用移动样品法，先对不感兴趣的视野聚焦，然后再移动样品把感兴趣的视野放到照像的区域。这种方法只限于在低倍数之下使用。 在高倍数下，先将光斑中心移到荧光屏一侧对图像进行聚焦，然后再将束斑中心移到荧光屏中心进行拍照，上述两种方法，主要是减少电子束对样品的照射时间。 一种最有效的办法是采用低温法。使样品处在低温的环境中。提高样品室内的真空度也可减少样品的辐射损伤。9减少样品污染的方法这里所提出的样品污染是指观察样品的过程中在镜筒内造成的污染。生物电镜技术9通常造成污染的原因： 真空泵油的倒流，各橡胶密封垫圈放气， 它们吸附在镜筒内表面上，当受到电子轰击时分
20、解成碳而造成样品污染。 采用冷却样品的办法是目前较有效的办法。实验证明样品温度在 20K 时污染率最小。 此外，操作时尽量减少电子束的照射时间。 操作熟练，分析目的明确。 倍数不宜过高，记录时关掉灯丝都是减少污染的有效方法。 关电镜前，一定把样品取出来，以免造成严重污染。第二章 透射电镜生物样品制备技术概述： 在医学生物学上所用的电子显微镜，发展最早和应用最广的是透射式的，它的成像是由一定强度的电子束透过标本而成像。 普通光学显微镜标本的厚度为 2-5m. 电镜切片 0.03-0.05m。这种厚度的切片叫做超薄切片。与其相关技术称为超薄切片术或称作透射电镜生物样品制备技术。电镜的分辨本领，在实
21、际应用中，一方面取决于电镜本身的分辨率，同时取决于标本的结构和反差；而标本的结构在很大程度上决定于标本制备技术。 一、标本制作过程：取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 电镜观察（一）取材1.取材要快，从动物中取材，力争在处死动物或组织离体后半分钟内将组织浸入固定液中。2.组织块要小，组织块的大小不允许超过 1mm3。3.低温操作，0 44避免人工损伤5选择部位准确可靠（二）固定用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程叫做固定。1固定的作用破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；稳定细胞物质成分；如核酸、核蛋白，糖类和脂类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，以保存组织成分。在一些细胞组份之间以化学反应和物理
22、反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空间构型；能提供一定的电子反差。生物电镜技术102固定剂在电镜生物样品制备中，常用的固定剂有：四氧化锇（OsO 4） ，醛类、高锰酸钾等。它们的性质分述如下：醛类：醛类固定剂有甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。（1 ）戊二醛(C 5H8O2)是一种毒性不大的良好的固定剂，其结构式为： O=CH-CH2-CH2-CH2-CH=O，具有两醛基，对细胞结构有高的亲和力 。 戊二醛的主要优点在于：戊二醛的单体分子小，穿透力强，固定速度快，它可以突破 1mm3 样品的界限。戊二醛的两个醛基，在固定时以交链作用使细胞成分得以稳定。具有稳定糖元，保存核酸、核蛋白的特点，
23、尤其对细胞膜系统和细胞基质有较好的固定作用。经戊二醛长时间固定的材料不会变脆，变黑。适合于长期保存样品或远离实验室的野外取材。适于进行超微细胞化学研究。 戊二醛的主要缺点：它对脂质不起固定作用。经戊二醛单独固定的组织经脱水之后大部分脂质被抽提而丢失。因此，它不适于单独作为电镜固定剂，最好作为锇酸固定的前固定剂使用。无电子染色作用，反差较弱。戊二醛固定不影响细胞的渗透性，因此对缓冲液的渗透压要求较高。它不能用醋酸-巴比妥缓冲液配制。 戊二醛固定液的配制：0.2mol 磷酸缓冲液：50ml，25%戊二醛水溶液：10ml ，加蒸馏水至 100ml，戊二醛的最终浓度 2.5%。必要时，可加无水氯化钙，
24、或氯化镁，使最终浓度达到 1-3mmol 但要注意避免形成沉淀，还可根据需要加入苦味酸等。（2 ）甲醛(CH 2O)是醛类中最简单的醛，其分子较小，渗透较戊二醛迅速。虽然甲醛对细胞精细结构的保存不如戌二醛，但在酶活性的保存方面却优于戌二醛，故甲醛一般用于组织化学或快速固定。并且对结构致密的种子及脆弱的脑组织有良好的固定作用。常用戊二醛和多聚甲醛配合的固定液作为前固定液，其配制方法为：10%多聚甲醛水溶液：20ml ，25%戊二醛水溶液：10ml，0.2mol 磷酸缓冲液：50ml，加蒸馏水至 100ml。其中，10% 多聚甲醛水溶液的配制：称取 2 克多聚甲醛加入到 20mL 蒸馏水中，加热搅拌至溶解，再加入几滴新鲜配制的 1mol NaOH，使溶液变得清亮。（注意：应在通风厨中操作）（3 ）四氧化锇（OsO 4）：俗称锇酸 ,是一种非电解质强氧化剂，常用浓度为 1%。 优点：与氮原子有极大的亲和力，故能与各种氨基酸、肽、及蛋白质反应，和蛋白化学结合并形成交链而使蛋白质得到稳定，故此能较完好地保存生物微细结构。与脂肪的不饱和脂肪酸链结合，形成脂肪-锇复合物。
