1、理解分子荧光分析的基本原理理解激发光谱发射光谱 同步光谱 三维荧光光谱的含义掌握分子荧光发射光谱的特性了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素了解光谱分析法的应用范围第一章 分子荧光光谱分析1 概述分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。 。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷
2、光。当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10 -9-10-6 S）停止; 当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10 -1-10 S）;磷光和荧光的发光机理是不同的。由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射
3、的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。2 荧光分析的原理2.1 分子荧光发生过程 2.1.1 荧光与磷光2.1.1.1 分子的电子能级与激发过程分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。.图 1 分子电子能级，振动能级和转动能级示意图室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能， 光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种
4、现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用 S0 S1 Sn 表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第 N 电子激发的单线态。T1 表示第一电子激发的三线态。电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。电子能态的的多重性用 M= 2S+1 表示 , S 为电子自旋量子数的代数和，其数值为 0 或 1。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量最低的各个轨道中。根据 Pauli 不相容原理,一个给定轨道中的两个电子，必定具有相
5、反方向的自旋，即自旋量子数分别为 1/2 和-1/2，其总自旋量子数S=0， 就是说基态没有净自旋 。分子的多重度 M=1，该分子体系便处于单线态，用符号 S 表示。大多数有机物分子的基态是处于单线态的。基态分子在吸收光能后其价电子从成键轨道或非成键轨道跃迁到高能量的反键轨道上，产生激发态分子，此为分子光吸收过程。但是激发态分子不稳定，通常很快失去能量回到基态。如果激发态分子在返回基态时以光辐射的形式失去能量，这种光辐射过程叫做光致发光。分子吸收能量后，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，这时分子处于激发的单线态。分子吸收能量后如果电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，这时分子便具有两个自
6、旋不配对的电子。即 S=1，分子的多重度 M= 2*1+1=3，这时分子处于激发的三线态，用符号 T 表示。处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋比成对自旋更稳定些（洪特规则） 。因此三线态的能级总是比相应的单线态能级略低。单线基态 激发单线态 激发三线态 图 2 单线态和三线态2.1.1.2 荧光的产生根据波滋曼分布(Boltzmann distribution ) 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动-转动能级，根据自旋禁率, 不能直接跃迁到激发三线态的振动 -转动能级。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和
7、无辐射跃迁等多种分子内去活化过程释放多余的能量而返回基态，发射荧光是其中途径之一。下面几种方式为基本去活化过程；振动弛豫：(VR vibrational relaxation ) 在溶液中的物质分子受入射光激发后形成的激发态分子，通过与溶剂分子碰撞，将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回同一电子激发态的最低振动能级。在这个过程中，分子被激发时吸收的能量不是以发出光辐射的形式耗散，因而属于无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级进行，所需时间约为 10-8 秒数量级。内转换：(IC Internal conversion): 指相同多重态电子能级中等能级间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子激发态之间
8、能量相差较小，以至其振动能级有重叠时，则可能发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低电子能级的激发态。上述的振动能级之间很接近时，内部能量转换容易发生。外转换（Ecexternal conversion）： 溶液中激发态分子与溶剂分子及其他溶质分子之间发生碰撞而消耗能量，所消耗的能量转换为热能。外转换常发生在第一激发单线态或第一激发三线态的最低振动能级向基态转换的过程中。转换时间为 10-9-10-7 秒，其发生可以降低荧光强度，这一现象叫荧光熄灭或猝灭。系间跨越 (Intersystem crossing, ISC)： 系间跨越指不同多重度状态之间的一种无辐射跃迁过程。它涉及到受激电子自旋状
9、态的改变 S1T1，使原来两个自旋配对的两个电子不再配对，这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子的能级的振动能级有较大的重叠时，例如激发单线态 S1 的最低振动能级与激发三线态 T1 的较高振动能级重叠, 则可能通过自旋-轨道耦合等作用使 S1 态转入 T1 态的某一振动能级.。系间跨越可以使荧光强度减弱或熄灭。荧光发射： （Fluorescence emission）.当分子被激发到任意一个激发单线态，并通过内转换及振动弛豫返回到第一激发单线态的最低振动能级后， 再以辐射形式发射光量子并返回到基态的各个不同的振动能级上，在这个过程中发射的光量子即称作荧光。由于从较高的激发态的振动能级返回到第一激发
10、单线态的最低振动能级耗散了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，所以发射荧光的波长比激发光的波长要长。发射荧光的过程约需 10-910-7 秒，电子返回到基态时可以停留在基态的任意振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个互相靠近的峰。通过进一步振动弛豫，这些电子很快回到基态的最低振动能级。根据kasha 规则，荧光多为 S1S0 跃迁。荧光产生的过程和条件：荧光物质产生荧光的过程可以分为 4 个步骤1 处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；2 被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，返
11、回到第一电子激发态的最低振动能级；3 返回到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；4 到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后返回的基态的最低振动能级。磷光发射 激发态分子通过振动弛豫下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过体系间跨越转移到激发三线态的高振动能级上。从单线态到三线态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而达到三线态的最低振动能级上。分子在三线态的最低振动能级可以停留一段时间，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射叫磷光。磷光与荧光的根本区别是荧光是由激发单线态最低振动能
12、级至基态各振动能级间跃迁产生的。由于激发三线态的最低振动能级比激发单线态的最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，亦即磷光的波长比荧光更长。从紫外光照射到发射荧光的时间约为 10 8 秒10 5 秒，而发射磷光则更迟一些，约在照射后 10 4 秒10 秒。图 2 荧光的产生2.1.2 分子荧光的激发光谱与发射光谱任何荧光化合物都有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱，这是定性和定量分析的基本参数和依据。激发光谱：荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发波长。这可由激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测定荧光强度的变化。以激发光波长为横坐
13、标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光化合物的激发光谱。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样，这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。区别在于紫外吸收光谱测定对紫外光的的吸收度，而荧光激发光谱测定发射的荧光强度。发射光谱： 简称荧光光谱。将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度得到荧光发射光谱。图 3 是室温下蒽在环己烷溶液中荧光激发光谱和发射光谱。从图中可见在蒽的激发光谱中 350nm 激发峰处有几个小峰，这是由于吸收能量后由基态跃迁到第一电子激发态中各个不同振动能级引起的。在蒽的
14、发射光谱中也有几个小峰，这是由于蒽分子从激发态中各个不同振动能级跃迁到基态中不同振动能级发射出的荧光量子的能量不同引起的。2.1.3 荧光光谱的特征： 2.1.3.1 Stockes 位移 在溶液荧光光谱中观察到的荧光发射光波长总是大于激发光波长，Stockes 1852 年首先观察到这种波长移动现象，因而称之为 Stockes 位移。激发峰位和发射峰位的波长差称为 Stockes 位移，它表示分子回到基态之前，在激发态寿命期间的能量消耗。用公式表示如下：单位是 cm-1Stockes 位移=10 7(1/ex -1/em)ex em 分别为校正后的最大激发波长和发射波长。Stockes 位移
15、说明在激发和发射之间存在着一定能量损失，激发态分子通过内转换和振动驰豫过程迅速到达第一激发单线态的最低振动能级，这是产生Stockes 位移的主要原因。激发态分子与溶剂分子的碰撞也造成能量损失，加大了 Stockes 位移。2.1.3.2 荧光发射光谱的形状与激发波长无关原因：荧光分子吸收了不同波长的激发光后可被激发到不同能级，然后通过振动弛豫和内部能量转换, 最终都将回到第一激发单线态的最低振动能级，再发射荧光。因此荧光发射与荧光物质的分子发射到哪个能级无关，即与激发能量无关。一般说来， 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关，激发电子都是从电子第一激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能
16、级，所以荧光发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.3.3 荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光物质的荧光发射光谱与激发光谱存在着近似的“镜像对称”关系。图 3 是蒽的荧光激发和发射光谱图.。 蒽的荧光激发光谱左边灰色图谱有一个 a 峰它是由分子吸收光后能后从基态 S0 跃迁到第二电子激发态 S2 形成的。在高分辨率的荧光光谱图上可以观察到 B0 b1、b2、b3、b4 、等小峰组成的一蔟，他们分别由是由分子吸收光能后从基态 S0 跃迁到第一电子激发态 S1 的各个振动能级形成的（见光谱图上方与之对应的能级示意图） 。各小峰间波长递减值与振动能级差有关，各个小峰的高度与跃迁几率有关（b1 的跃迁几率
17、最大，b0次之，b2、b3、b4 依次递减。蒽的荧光发射光谱（右边黑色图谱）同样包含C0、C1、C2、C3、C4 一蔟小峰, 他们分别由分子从第一电子激发态 S1 的最低振动能级跃迁至基态 S0 的各个振动能级发出光辐射形成的。由于电子基态的振动能级分布与与激发态相似但不相同 , b1 峰与 c1 峰 b2 峰与 c2 峰都是以 b2 为中心基本对称。再加上 C0、C1、C2、等峰的高度也与跃迁几率有关，c1 的跃迁几率最大， c0 次之， c2、c3、c4 依次递减.）因此形成了激发光谱和荧光发射光谱的对称镜像现象。2.2 荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系是一个比较重要问题，弄清他们
18、之间的关系可以预示分子能否发生荧光，在什麽条件下发生荧光。这对研究分子荧光分析的应用很有意义。2.2.1 荧光寿命与荧光效率荧光寿命与荧光效率是荧光物质重要的发光参数荧光寿命 Fluorescence life time)：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间称为荧光寿命。常用 f。 表示。当荧光物质受到一个极短的光脉冲激发后，它从激发态跃迁到基态的变化可用指数衰减规则表示：Ft=F0e-Kt. 式中 F0， ， Ft 分别是在激发开始 t=0 和激发后时间 t 的荧光强度，K 是衰减常数。假定在时间 t=f 测得得荧光强度 Ft 为 F0 的 1/e
19、 ，即 Ft=1/e F0， 根据上述公式，1/e F0 = F0e-Kf ， 由此得到1/e= e-Kf Kf=1，K=1/f所以上述公式可以写成 Ft= F0e-Kf 或者 Ln F0/Ft = t/f如果以 Ln F0/Ft 对时间 t 作图 ，直线斜率即为 1/f。由此可以计算出荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。荧光效率（Fluorescence Efficiency）：又称为荧光量子产率(Fluorescencequantum yield)；是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，它表示物质发射荧光的能力。通常用下式表示 ff = 发
20、射荧光的光子/吸收激发光的光子= Kf/( Kf + Ki ) Kf 荧光发射过程的速率常数，Ki 为其他有关过程的速率常数之和。许多物质并不发射荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除了荧光发射外，还有许多辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。 如果在受激分子回到基态过程中没有其它去活化过程与荧光发射过程进行竞争，那麽在这一段时间内，所有激发态分子都将以发射荧光的方式回到基态，这一体系的荧光效率等于 1。事实上，任何物质的荧光效率不可能等于 1，而是在 01 之间。例如一些被作为荧光标准物质的 9-氨基口丫啶（在水中） ，为0.99；蒽在乙醇中为 0.30 ;硫酸奎宁二水化合物（在 0.5 mol
21、/l 硫酸溶液中）为0.55。荧光效率低的物质即使有较强的紫外吸收，所吸收的能量都以无幅射跃迁形式释放，内转换外转换的速度很快，所以没有荧光发射。2.2.2 分子结构与荧光的关系2.2.2.1 物质分子产生荧光的条件物质分子产生荧光必须具备两个条件；1 物质分子必须具有与照射的辐射频率相适应的吸收结构，才能吸收激发光； 实验表明，分子结构中含有*跃迁或 n*跃迁的化合物都有紫外可见吸收，但 n*跃迁引起的 R 带是弱吸收带，电子跃迁几率小，由此引起的荧光很弱。所以实际上只有分子结构中存在*跃迁，也就是 K 带强吸收时才可能有荧光发生。2 吸收了与其本身特征频率相同的能量后必须具有一定的荧光量子产率。2.2.2.2 分子结构与荧光性质荧光通常发生在具有共轭双键体系的分子中。能产生荧光的分子都具有共轭双键和大键。长共轭结构绝大多数荧光物质都含有芳环或杂环，因为具有这些结构的分子具有长共轭的*跃迁。电子的共轭程度越大，荧光强度越大，而荧光波长也将红移。如苯萘蕙三个化合物的共轭结构与所发射的荧光的关系如下 ：
