1、#*腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM 操作手册目 录第一章 简介 1第二章 应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章 主要流程 44.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组 AdEasyTM 转移载体 54.2 细菌内 AdEasyTM 重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM 重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM 重组子转染 QBI-
2、293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章 常用技术 85.1 QBI-293A 细胞培养 85.1.1 QBI-293A 细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A 细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A 细胞的冻存 85.2 QBI-293A 细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染 QBI-293A 细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI 测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal 染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表
3、达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western 杂交 135.5.4 Southern 杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物 PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在 QBI-293A 细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20
4、第六章 疑难解答 226.1 QBI-293A 细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在 BJ5183 细胞中共转化和重组 246.5 转染 QBI-293A 细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在 QBI-293A 细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写 英文全称 中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清 5 型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素-Gal -Galactos
5、idase -半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补 DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋 DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应#*CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM 培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Dia
6、mine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB 培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell
7、) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使 RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl
8、 Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐 /乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE 溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4- 氯-3-吲哚 -D-半乳糖苷第一章 简 介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断
9、性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953 年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了 40 多种不同血清型和 93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields 等，1996）。1977 年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺
10、病毒（Graham 等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999 和 Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有#*熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒 Adeno-QuestTM 系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在 293 细胞中产生重组腺病毒
11、。现在介绍的 AdEasyTM 系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（ He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM 转移载体可允许插入 7.5kb 的外源 DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在 QBI-293A 细胞中扩增并纯化到 1012VP 的操作步骤。AdEasyTM 载体系统包含了生产 5 型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分
12、购买后即可使用。第二章 应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此 DNA 转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生 1010 到 1011VP/m
13、l，浓缩后可达 1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。4. 无需辅助病毒，可容纳 7.5 kb 外源 DNA为提供克隆空间，此腺病毒缺失了 E1 和 E3 早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒 DNA 稍大的DNA 分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达 7.5kb。5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活
14、癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。7. 能在悬浮培养液中扩增293 细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮 293 细胞可在 120L 的生物反应器中表达重组蛋白。8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的 MOI 比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达
15、情况。第三章 AdEasyTM 技术3.1 技术概览AdEasyTM 系统是由 T.C.He 等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒 DNA 是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。#*在 AdEasyTM 载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性 DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒 DNA 操作更容易
16、，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因 cDNA 插入一个转移载体，将得到的质粒用 PmeI 线性化，然后在大肠杆菌 BJ5183 中与病毒 DNA 质粒 pAdEasy-1 进行同源重组。pAdEasy-1 缺失了 E1 和 E3 区，其 E1 区功能将在 293A 细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用 PmeI 线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR ，Iaverted Termined Repeats），转染 QBI-293A 细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整
17、的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183 有 recA 活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无 recA、endA 活性的细菌株如 DH5 等进行扩增。由于缺乏 recA 活性，DH5 不能用于腺病毒的同源重组。3.2 Ad EasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程与传统系统相比，AdEasyTM 系统中筛选和纯化腺病毒所需
18、的时间大大缩短了。克隆和筛选约需 1-3 周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在 DH5 中扩增后转入哺乳动物细胞 293A，最后将 293A 细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供 E1 区功能的293A 细胞中进行增殖。一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需 1 小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而 AdEasyTM 载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。我们强烈建议初学者用 QBI-Infect阳性对照进行感染力测定（见 5.2.2）。进行这些测定之前，必须
19、先扩增 QBI-293A 细胞（见 5.5.1）。感染力测定使你能观察到病毒增殖导致的细胞表型的改变，获知你所用细胞对腺病毒的敏感性，而病毒空斑测定可让你观察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体AdEasyTM 系统中有 2 种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle 和 pShuttle-CMV，这 2 个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle 不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和 polyA 位点的表达盒。pShuttle-CMV 含有单拷贝 CMV 启动子和 polyA 位点供基础表达
20、和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入 pShuttle-CMV 的多克隆位点。表 1 提供了各转移载体的特性。表 1 AdEasyTM 转移载体特性载体名称 克隆能力 启动子 polyA 位点 克隆位点 线性化位点 说明pShuttle 7.5kb MCS 共转化位点 PmeI（ECoRI）转染位点（PacI） 将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点 PmeI（ECoRI）转染位点（PacI） CMV 启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白4.1.1 克隆的一般原则AdEasyTM 转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用
21、，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：1） 在 BJ5183 中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表 1 中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在 pShuttle 中用 EcoRI 线性化时，需要用 RecA 辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。2） 重组腺病毒质粒在转染 QBI-293A 细胞之前也必须用 PacI 进行线性化。同样，插入基因中不能含有PacI 位点，如果有则必须进行定向突变。#*3） 克隆能力是指质粒载体能够克隆并且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表 1，建议插入基因的长度最好不超
22、过它的上限。在 pShuttle 和 pShuttle-CMV 中分别插入大于7.5kb 和 6.6kb 的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生 DNA 重排，生长速度也将减慢。4） 如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如 CMV 启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。5） 在进行构建腺病毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表达。这里没有提供详细的操作方法，但在 CMV或其它强力启动子控制下的基因很容易进行暂时性表达实验。但某些启动子控制下的蛋白表达水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水平。6） 载体 DNA 可用氯化铯溴化乙锭平衡
23、密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的DNA 进行转化和转染实验，因为污染的 DNA 将大大降低菌落和空斑的形成数。4.1.2 构建重组 AdEasyTM 转移载体构建重组 AdEasyTM 转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手册。1 若 cDNA 含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没有，可以使用钝末端内切酶位点，也可用含合适的酶切位点的引物进行 PCR 或连接含有酶切位点的接头使 cDNA 产生新的酶切位点。PCR 插入酶切位点的方法较快速，但对于长 cDNA 则应使用连接接头，因为在扩增过程中
24、Taq酶可能会使序列的某些位点发生突变。2 插入基因的鉴定可以用限制性内切酶分析或 PCR 的方法。3 转化之前用 PmeI 或 EcoRI 将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。4 琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入 65 20 分钟进行灭活。5 凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。6 重悬纯化的 DNA，浓度至少为 0.2ug/ul。每个转化实验取 1ug 进行，包括对照。4.2 细菌内 AdEasyTM 重组子的产生4.2.1 共转染的一般原则1） 将线性
25、化转移载体和 pAdEasyTM-1 DNA 共转化 BJ5183 必须要用高活性的感受态细胞。试剂盒中提供的细菌为电穿孔感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转化活性（108 已足够）。2） DH5 不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒 DNA。3） 本实验需要 2ug 线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需 1ug。4.2.2 共转化方法同时进行实验组和对照组的转化实验：实验组共转化：1ug 线性化重组转移载体（5ul）和 1.0ul pAdEasyTM-1 载体（100ug/ul）对照组转化：1ug（
26、5ul）线性化重组转移载体1 将 BJ5183 感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为 2 管，每管 40ul。2 40ul 感受态细胞中至多加入 6ul DNA，且 DNA 必须溶于水，避免含有离子。3 将 BJ5183 转入 2mm 电穿孔杯，防止有气泡形成。4 按电穿孔供应商的使用说明转化 BJ5183，Bio-Rad 仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX 仪器则为：5 Ohms、2.5KV 、C=0。5 用 1mlLB 重悬转化物。6 转入 1550ml 离心管中，37震荡培养 60 分钟。7 将转化物铺 35 块 LB/Kan（50ug/ml ）培养
27、板，37培养 24 小时。建议分别铺 100、300 和 600ul，以提高至少在一块板中得到可分离菌落的机率，应该得到 40100 个菌落。#*8 挑出 24 个最好的克隆，转入 2ml LB/Kan（50ug/ml ）培养液中培养 1015 个小时。不要储存 BJ5183培养液，因有可能产生非目的重组子。尽快抽提重组 AdEasyTM 质粒。9 用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行 0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的试剂盒应避免使用，但粘粒 DNA 抽提试剂盒可以用。重组质粒大小约 40kb，由于它是低拷贝质粒，所以小量制备时应相应调整具体操作。4.2.
28、3 预期结果20%以上的菌落应含有大质粒（近 40kb），这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组 recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。4.3 AdEasyTM 重组质粒的筛选和扩增将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI 酶切后通常得到约 30kb 的片段和一个 3.0 或 4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入 DH5 中进行扩增：转化 DH5 只需 1-5ul 小量制
29、备的重组子。这一步对于扩增时保持重组 DNA 的结构是必需的，因为 AdEasyTM 这样的大质粒在 recA+细菌株如 BJ5183 中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在 DH5 中能很容易地获得大量 DNA。1 将 DH5 感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。2 将 1-5ul DNA 加入 40ul DH5 感受态细胞中，DNA 必须用水溶，避免含有离子。3 将 DH5 感受态细胞转入 2mm 电穿孔杯，防止形成气泡。4 按照说明转化 DH5：Bio-Rad 仪器一般使用的参数为：200 Ohms 、25uF、2.5KV；BTX 仪器则为：50 Ohms、2.5KV、C=0。5 将转化混合液重悬
30、于 1ml LB 中。6 转入 15-50ml 离心管中，37振荡培养 60 分钟。7 培养后用 LB 按一定梯度稀释转化的 DH5（1:10、1:100 和 1:1000）8 取 100ul 转化液铺在 LB/Kan（50ug/ml）板上，37培养 24 小时。未用的转化液可在 4保存-2 周。9 每个重组子挑 13 个克隆转入 5ml LB 扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。10 用柱纯化试剂盒制备至少 5ug 高质量的重组 DNA。11 取 5ug 质粒用 PacI 消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于 50u
31、l 0.1TE 溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前 DNA 制备的内容。4.4 AdEasyTM 重组子转染 QBI-293A 细胞注意：培养细胞前先参阅 5.1 章中有关 QBI-293A 细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点：无菌在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所用其它试剂也均为无菌。DNA 纯度磷酸钙转染中所用的 DNA 必须是高纯度的，一些 DNA 污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会被污染物杀死。沉淀时间以前的资料都建议磷酸钙- DNA 共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应
32、20 分钟。然而与此相反，最近的研究（Jordan 等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建议共沉淀成分混合后 1 分钟即可将沉淀加入细胞培养板。这一时间上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。4.4.1 细胞铺板每块板都用 DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到 70%汇合率。由于共转染是通过细胞#*表面完成的，因此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。1 转染前一天以 7.5105 QBI-293A 细胞在 60mm 培养皿中铺板，用 DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到 1.01.5106。37 CO2 孵箱中培养。 CO2
33、孵箱有助于保持合适的 PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在 CO2 孵箱中。2 转染前 3-4 小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的生长力。将培养皿放回 CO2孵箱中。4.4.2 磷酸钙转化技术1 每个转染都必须用 5ug 无菌的线性化重组腺病毒 DNA。2 标记一个 1.5ml 离心管为编号 1。用微量移液枪加入 169ul 无菌水和 5ul 2M 氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入 50ul AdV DNA 溶液和 26ul 2M 氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为 250ul，含有 0.25M 氯化钙和 5ug DNA。3 准备第 2 管离
34、心管（编号 2），加入 250ul 2HBS 缓冲液。4 用 1ml 移液枪吹打 2 号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入 1 号管的溶液。加完后继续吹打5 秒以使其完全混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分钟后再加入细胞培养皿内。5 在超净台内将磷酸钙-DNA 共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。6 培养皿放入孵箱培养过夜。4 小时后，沉淀颗粒在 200倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。7 第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用 PBS 制备的
35、 1mM EDTA 溶液洗一次，PBS 洗 2 次。注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将 PBS 沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液枪反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8 将细胞分装入 4 个 60mm 培养皿（每个培养皿中加 5ml DMEM5%）或一块 6 孔板中（每孔加 3ml DMEM5%），静置 6 小时使其贴壁。6 小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。第五章 常用技术5.1 QBI-293A 细胞培养昆腾公司的 293A 细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株
36、对于高细胞密度很敏感，当细胞超过 70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在 70%以下，QBI-293A 细胞则能连续培养 34 个月维持原有细胞特性。若以购买得到的 293 作为第一代，则 30 代内能得到最佳结果。一旦到了 30 代，最好复苏一管细胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的 QBI-293A 细胞库。QBI-293A 细胞在 DMEM 培养液中培养，该培养液还含有 4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L 丙酮酸钠、2mM 谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为 2%10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为 DMEM
37、 后加血清浓度（如：DMEM5%表示：含有 4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L 丙酮酸钠、终浓度为2mM 的谷氨酰胺和终浓度为 5%的热灭活胎牛血清）。QBI-293A 细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。QBI-293A 细胞生长的相对密度见下表：表 2：汇合率与细胞数量汇合率(%) 60mm 培养皿 100mm 培养皿50 1.60106 3
38、.5106#*75 2.40106 5.25106100 3.20106 7.001065.1.1 QBI-293A 细胞初始培养1. 将冻存的一管 QBI-293A 细胞在 37水浴轻轻晃动融化。2. 融化后在超净台无菌条件下用 70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。3. 将细胞转入 15mL 无菌离心管中，加入 10mL DMEM 10%，600g 离心 5 分钟使细胞沉淀。4. 弃去上清。5. 将细胞用 10mL DMEM 10%重悬，轻轻打匀6. 转入 75cm2 培养瓶或 100mm 培养皿中培养。7. 在 5% CO2 孵箱中 37培养过夜。8. 第二天观察细胞汇合率，若合适则可进行实
39、验，否则按 5.1.2 所述继续培养。5.1.2 QBI-293A 细胞的维持培养和增殖QBI-293A 细胞必须按 1:10 到 1:20 传代1. 室温下胰酶消化 13 分钟使贴壁细胞脱落2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落，在倒置显微镜下观察细胞是否变圆，是否已从培养瓶表面脱落。3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液，转入新的培养瓶中。在 5% FBS 中，细胞倍增的时间是 26 小时，在 10% FBS 中稍短一些。5.1.3 QBI-293A 细胞的冻存建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于 50%，以保证亚克隆的特定表型。1. QBI-293A 细胞必须在含 10%高质量 FBS 的 DM
40、EM 中培养。2. 将健康生长的 QBI-293A 细胞离心沉淀。3. 以最小体积的 DMEM 10%重悬细胞。4. 用血球计数器进行细胞计数。5. 用 DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS 重悬细胞，细胞终浓度为 1106/mL。6. 无菌操作将 1mL 细胞悬液转入 2mL 冻存管中。7. 将冻存管放入冻存盒中，-80 储存 24 小时。这一简便措施可保持约 1/分钟的降温速率，适于冻存细胞。8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150冰箱中长期保存。QBI-293A 细胞若正确冻存，则可在液氮罐中保存数年。5.2 QBI-293A 细胞的感染和病毒空斑的产生感染 QBI
41、-293A 细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A 细胞感染后不同时间的具体变化。5.2.1 感染 QBI-293A 细胞QBI-293A 细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。1020 的 MOI 值通常用于需要同时感染所有细胞时，此时细胞汇合率应该在 9095%左右，
42、因为细胞在感染数小时内将停止生长。加入病毒的量可通过 MOI 值测定（见 5.3）或病毒滴度测定（见 5.8）确定。在这个 MOI 值条件下，被感染细胞的形态在 12 天后就会完全改变：细胞变圆并逐渐从壁上脱落（见5.2.2）。随着病毒的增殖，细胞核将占据细胞的大部分，这一表现称为细胞病理效应（CPE）。感染后 3天，所有细胞都将呈现 CPE。当 QBI-293A 细胞在 MOI 值为 1 或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的#*细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要 4 天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染时达到 100
43、%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后 5 天可见大多数细胞呈现 CPE 而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初 2 小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。5.2.2 病毒空斑形成病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是一个缓慢的
44、过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到 100%汇合。为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。感染后 7 天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现 CPE。第 10 天可以在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到 14 天，空斑可非常容易地被挑选出来。5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。琼脂糖/D
45、MEM 混合物制备：1. 用无菌 PBS 制备 5% SeaPlaque 琼脂糖（FMC 产品）储存液，高压消毒后每管 10mL 分装在 50mL 塑料离心管中，4保存。2. 使用之前先在微波炉中融化 5% SeaPlaque 琼脂糖（避免沸腾），然后冷至 45。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。3. 加入 30mL 预平衡至 37的 DMEM5% 后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为 1.25%。立即使用。覆盖 QBI-293A 细胞：在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。1. 移去培养液，用 1.25%琼脂糖/DMEM 混合物覆盖单层
46、细胞。2. 沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表 3，然后放回 CO2 孵箱培养。表 3：不同培养器皿应用的琼脂糖体积培养皿大小 首次量 追加量100 mm 10 mL 5 mL60 mm 5 mL 3 mL6 孔板 3 mL 1.5 mL空斑应在 1021 天内形成，为保持细胞活力，每 45 天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM 混合物。5.3 MOI 测定这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量（精确测定病毒颗粒数量见 5.8 节的滴度测定）。MOI测定通常在扩增病毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。这一实验可在含有 1106QBI-293A 细胞/孔
47、的 6 孔板中进行。1. 移去培养液，每孔加入 500L 新鲜的培养液2. 一孔为对照，其余每孔分别加入 2、5、10、25、50L 病毒上清。3. 不断缓慢晃动培养板，培养约 3 小时。4. 加入 1.5mL 新鲜培养液培养 72 小时。观察每孔细胞是否出现 CPE，根据预先的估计，感染后 3 天细胞完全出现 CPE 的病毒 MOI 值为 1020。这样，根据感染的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。#*5.4 腺病毒感染力测定这一实验的目的是确定腺病毒是否能将 DNA 转导入 293 之外的某一细胞株。该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的
48、病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。这个实验中，如果用的是 Ad5-CMV-LacZ 则检测 -半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP 或Ad5-CMV5-GFP 则检测 GFP。这些高滴度的产品都可单独向昆腾公司购买。本实验的阳性对照（ -半乳糖苷酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而不适于直接进行实验，通常需要扩增以达到理想的病毒滴度（扩增步骤见 5.6）。腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样，其中尤以淋巴细胞株最难转导。腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行，MOI 为 1200，当测定淋巴细胞株时 MOI 可至 1000。对大多数细胞株来说，150 的 MOI 值可将报
49、告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高 MOI 情况下，某些病毒蛋白的高表达可对某些细胞产生毒性。无论 MOI 为多少，感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动，以使感染效果达到最佳。1. 按 5.2.1 中所述方法在 6 孔板中用不同数量病毒感染细胞（合适的 MOI 范围），培养 48 小时。2. 进行 X-gal 染色（见下述）。注意细胞与病毒培养后不必清洗细胞，在整个实验过程中让病毒留在培养液中。5.4.1 X-gal 染色1. 弃去培养液，用 37预热的 PBS 冲洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆盖细胞，0.05%戊二醛室温孵育 515 分钟或 2%多聚甲醛室温孵育 60 分钟。2. 弃去固定液，室温下用 PBS 彻底洗 3 遍：第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留 5分钟。3. 加入最小体积的 X-gal 溶液。4. 37孵育 1 至 12 小时（过夜），阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于 4保存。溶液：a） 戊二醛固定液使用前将戊二醛用 PBS 稀释至终浓度为 0.05%。b） 多聚甲醛固
