1、实验 内生真菌的分离及鉴定实验学时：18 实验类型：综合实验要求：选修一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和 ITS 序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1 样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用 75 酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼 15 秒至表面焦糊
2、，切成 11cm2 大小置于 PDA 固体培养基上。对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75 的酒精漂（浸）洗 2-3min无菌水冲洗 4-6 次0.1 升汞不同的消毒时间（共设置 7 个梯度）无菌水冲洗 4-6 次用灭菌滤纸吸干多余水分无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成 0.50.5cm2 大小。 将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前 1-2 分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注
3、意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。1.2 内生真菌的分离与纯化 将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养 5 块组织块）于 27恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。观察菌丝生长情况及污染情况。培养 3-4 天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜 PDA 培养基上。纯化 3-4 次以保证所得菌落为纯培养。2、真菌的形态学鉴定方法 对分离到的内生真菌的分类鉴定
4、主要根据宏观的培养性状（菌落形态），微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典分类研究。2.1 培养性状（菌落形态） 培养基：查氏培养基（Czapek agar）、沙氏培养基和 PDA 培养基。 方法：将固体培养基制成平板，以点植法接钟，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板的中心位置，然后于 25-28培养一定时间（通常为 7 天或 14 天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜等。 观察的要点： 大小：以菌落的直径（mm ）表示。 颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。 菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。 菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉
5、粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。 菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。 菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。 渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。2.2 个体形态 菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等 分生孢子梗：分支情况-简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光滑等。 产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体） 分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成头）2.3 真菌制片方法粘片法 胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75 乙醇固定，乳酸石
6、炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。2.4 显微摄影照片 在 Motic 数码显微镜下，观察并选取具典型性状特征的视野拍照、直接测量相关数据和进行描述记载。2.5 菌种的鉴定根据描述的菌种的特征，索引分析相关文献，综合分析对比相关特征的异同，最后确定待定菌株的分类地位。3、真菌的分子生物学鉴定方法3.1 真菌菌丝的获得（1）固体培养基培养菌丝体 对于气生菌丝较多的真菌可以选择 PDA 固体培养基在培养皿上培养，在固体培养基平板上铺一层玻璃纸，27培养 5-7 天。将 3-4 个用培养皿平行培养的新鲜菌丝小心地刮下，收集在一起，以备进行 DNA 提
7、取。在刮取菌丝体时，要注意的是不要把培养基一起刮下来，以免对提取 DNA 造成影响。（2）液体培养基培养菌丝体 培养基成分与不加琼脂的 PDA 固体培养基成分相同。将液体培养基以 100mL 每瓶分装至 250mL 三角瓶中， 8 层纱布封口。 用 121，蒸汽灭菌 20min。 将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中 27、120rpm培养 5-7 天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球 5 次，避免培养基中的糖类和蛋白对 DNA 提取的影响。40下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行 DNA 的提取。3.2 基因组 DNA 的提取DNA 提取采用 CTAB 法
8、。CTAB（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇。CTAB 法的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的 DNA。用 CTAB 法提取材料 DNA 的具体步骤如下：1 将 CTAB buffer 在 65水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；2 取 0.1g 左右菌丝体，在液氮
9、中迅速研磨成粉末后，迅速加入 5mL 预热的提取液及 10L-巯基乙醇，混合均匀后把混合液转入 1.5mL 离心管中 700L/管；3 于 65水浴保温 0.5-1h，时间不能超过 1.5h。保温期间要轻轻振摇几次；4 冷却至室温后，加入等体积 700L 的饱和酚：氯仿：异戊醇25：24：1，充分混匀后静置 10min5 离心 12000rpm，10min，室温，去沉淀，将上清液转入干净离心管中。6 根据杂质的去除情况重复步骤 4、5 数次，直至无杂质；7 加入等体积氯仿：异戊醇 24：1 抽提一次以去除饱和酚，离心12000rpm，10min，室温；8 将上清液逐滴加入两倍体积的-20预冷无
10、水乙醇，以沉淀出 DNA。室温放置 10-20min，可以过夜；9 挑取或离心去上清液 10000 rpm，5min 的方法取出 DNA；用 75乙醇洗涤两次；10 37保温箱中干燥后溶于适量的 TE 缓冲液中 4备用。3.3 多聚酶链式反应 PCR 扩增3.3.1 引物ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC3.3.2 扩增条件扩增体系 PCR 反应体系为 50L 体系，包括：10PCR buffer： 1/10MgCl2 ： 1.5mM，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）： 各 200M，Primer1 0.
11、2M，Primer2 0.2M， Taq 酶： 12.5U，DNA 模板： 约 100ng。扩增条件 预变性 95 5min 变性 95 1min 复性 51 1min 3035 个循环 延伸 72 1min 延伸补齐 72 10min3.3.3 扩增产物的纯化及序列的测定 送测序公司。4、保存方法 将所分离的所有纯化菌株采用两种方法保存。 斜面低温保藏法： 将菌株接种至 PDA 固体斜面培养基上于 27下培养，待菌落长满斜面，观察没有污染后，放于 4的冰箱中保存。这种保藏方法适合本实验条件下各菌种的保藏，保藏时间为三个月到六个月，传代次数过多时容易导致菌种变异退化。 无菌水保存法：在柱形 E
12、ppendorf 离心管中加入 2/3 体积的蒸馏水，蒸汽灭菌，将带有菌丝的琼脂小块放入无菌水中，4的冰箱中保存。此法保存菌株的时间要长于斜面保存。用这种保藏方法可以保藏 1-2 年。比较而言这种方法是较好的菌种保藏方法。四、实验组织运行要求 采用“集中授课，学生自主训练为主的开放模式组织教学。”五、实验条件 仪器设备：高压蒸汽灭菌锅，培养箱，调温电炉、摇床、磁力搅拌器、15W 紫外灯、超净工作台、离心机等。1.5mL eppendorf 离心管，研钵，解剖刀，镊子，纱布，滤纸，三角瓶等；胶带，剪刀，镊子，解剖刀，纱布，滤纸，脱脂棉，三角瓶，9或 10cm 培养皿，玻璃棒，接种钩，接种环 药品
13、和试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P043H2O、 MgSO47H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75 的乙醇，0.1 升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯 10），30 双氧水。双蒸水、琼脂糖，Tris 饱和酚、巯基乙醇 - Mercaptoethanol，石英砂，Tris 饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。六、实验步骤 （一） 培养基配置 1、马铃薯、葡萄糖琼脂培养基 马铃薯汁 1000ml，葡萄糖 20g，琼脂 20g（注：取去皮马铃薯 200
14、克，切成小块，加水 1000 毫升煮沸 30 分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至 1000 毫升，加葡萄糖 20 克，琼脂 15 克，溶化后分装，15 磅灭菌 30 分钟。） 2、察氏琼脂培养基 蔗糖 30g，NaNO3 3g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，K2HPO41g，琼脂 13g，蒸馏水 1000ml，自然 pH 3、沙氏培养基 蛋白胨 1g，葡萄糖或麦芽糖 4 g，琼脂 1.5 克，水 100 ml。 制法：1 将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调 PH 即有 5 左右）分中号试管（约 4 毫升）包扎，高压 11520 分钟。趁
15、热斜好，凝固备用。4、马丁氏培养基 葡萄糖 10g， KH 蛋白胨 5g， 2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1 孟加拉红 3.3mL，琼脂 20g， 水 1000mL，pH 值自然。 抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素 40U/mL，青霉素 30U/mL 用量加入，冷却到 45左右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。乳酸石炭酸棉蓝染色液 棉蓝（苯胺蓝或甲基蓝） 0.025g，乳酸（比重 1.20）10g 石炭酸（结晶）10g，甘油（比重 1.25）20g，蒸馏水 10 mL。（二）实验步骤 1、采样 2、内生真菌分离、纯化并保存菌种 3、菌种形态鉴定 （1）将 4保存菌种
16、活化 2 次； （2）将活化菌种分别点种 PDA、沙氏、察氏平板，每重复 3； （3）25恒温培养箱培养 7 天； （4）然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形态； （5）另两个平行继续培养至 14 天，取出； （6）重复步骤 4，作为最终描述结果； （7）根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。4、分子生物学鉴定（1）菌种培养，获取菌丝体（2）提取基因组 DNA（3）PCR 扩增 ITS 序列（4）测序（5）序列分析（6）结合形态特征对菌株进行初步鉴定琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般
17、可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶约可区分相差 100bp 的 DNA 片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段 DNA。普通琼脂糖凝胶分离 DNA 的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达 107bp 的 DNA 片段。 操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 注意 DNA 酶污染的仪器可能会降解 DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个 bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大 DNA 链应该使用脉冲凝胶电
18、泳。注意巨大的 DNA 链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0.52之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 DNA 带不易分辨，造成条带缺失现象。 适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有 TAE 和 TBE，而 TBE 比 TAE 有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使 DNA 电泳产生条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。 电泳
19、的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过 20V/cm，电泳温度应该低于 30，对于巨大的 DNA 电泳，温度应该低于 15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA 样品的纯度和状态 是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA 样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的 DNA 样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的 DNA 条带迁移。在上样前不要对 DNA 样品加热，用 20mM N
20、aCl 缓冲液稀释可以防止 DNA 变性。 DNA 的上样 正确的 DNA 上样量是条带清晰的保证。注意太多的 DNA 上样量可能导致 DNA 带型模糊，而太小的 DNA 上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN 公司 DNA 分子量标准每次上样 6ul 即可得到清晰均匀的条带。 Marker 的选择 DNA 电泳一定要使用 DNA Marker 或已知大小的正对照 DNA 来估计 DNA 片段大小。Marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN 公司的 DNA Marker 条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。
21、需要注意的是 Marker 的电泳同样也要符合 DNA 电泳的操作标准。如果选择DNA/HindIII 或者 DNA/EcoRI 的酶切 Marker，需要预先 65加热 5min，冰上冷却后使用。从而避免 HindIII 或 EcoRI 酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB ），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如 SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统 EB 染料高 10 倍以上
22、。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。步骤如下： 1. 制备 1%琼脂糖凝胶(大胶用 70ml,小胶用 50ml): 称取 0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入 70 ml(50ml)1TAE,瓶口倒扣小烧杯 .微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到 65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上
23、,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1TAE 电泳缓冲液至没过胶板 1-2为止. 3. 加样:在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液 ,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于 1X.用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳 ,电压 60-100V,样品由负极(黑色) 向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶
24、的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有 0.5 ug/ml 的溴化乙锭 1TAE 溶液染色约 20 min,再用清水漂洗 10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带 ,采用凝胶成像系统拍照保存.TAE 是使用最广泛的缓冲系统 。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际 相对分子质量（TBE 中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状 DNA 在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约 10%，电泳大于 13kb 的片段时用 TAE 缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收 DNA 片段时也易用 TAE 缓冲系统进行电泳。TAE 的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。TAE 的配方： 150TAE Buffer 配制方法：1。称量 Tris 242g，Na2EDTA.2H2O37.2g 于 1L 烧杯中；2。向烧杯中加入约 800ml 去离子水，充分搅拌均匀；3。加入 57.1ml 的冰乙酸，充分溶解；4。用 NaOH 调 pH 至 8.3，加去离子水定容至 1L 后，室温保存。使用时稀释 50 倍或 100 倍 即 1TAE Buffer 或 0.5TAE2
