1、植物讯号组件 eds1 和 sgt1 加强疾病所造成的 necrotrophic 病原灰霉病穆罕默德 oirdi 和 Kamal bouarab中心研究和恩 amlioration vgtale ，省德 biologie ，系陶瓷实验室，大学舍布鲁克， 2500 林荫大道德大学，舍布鲁克（魁北克），j1k2r1，加拿大作者函授：卡迈勒 bouarab，电话：+1819 821.707，传真：+18198218049，电子邮件：kamal.bouarab usherbrooke.ca摘要：灰霉病是一种真菌 necrotrophic 造成灰霉病就广泛的食品植物，特别是葡萄，番茄，软的水果和蔬菜。这
2、种病带来了重大的经济损失，在这两个前和采后的作物。成功保护寄主植物对这种病菌是严重阻碍缺乏抗性基因在宿主和相当大的表型的多样性青霉菌。本研究的目的是要测试是否灰霉病操纵免疫信号通路在植物中，以恢复其疾病。我们表明了，灰霉病引起的疾病，在烟草系统研究通过活化的两种植物基因讯号，eds1和 sgt1，这已被证明至为必要，为反抗 biotrophic 病原体以及更有趣的是， 病毒诱导基因沉默的这两种植物的讯号组件增强系统研究抗药性灰霉病。最后，植物表达杆状病毒抗蛋白 p35 基因是比野生型植物更能抵抗这种病原 necrotrophic。这项工作突出了一个新的策略，用灰霉病建立疾病。这信息是重要的战略
3、设计，以改善植物病原菌阻力。关键词：抗蛋白质，灰霉病，反防卫战略，eds1，植物抗辩，sgt1，茄科。新 phytologist （2007）175 ：131-139 。作者（ 2007 ） 。杂志汇编。新 phytologist （2007）10.1111/j.1469-8137.2007.02086.x。导言阻止其蔓延，从工地的企图感染，并涉及可能积极植物代谢（拉文等人，植物携带监测系统，以确认攻击 1996）。的 R 基因介导的耐药性，也是与微生物和诱导有效的防御机制。激活一个水杨酸（SA ）依赖信令阻力往往是由一个基因对基因相互作用的途径，导致表达某些病程植物之间的阻力（R）基因与病原
4、无毒链（PR ）的蛋白质，它被认为是贡献（器）的基因（哈蒙德-科萨奇琼斯，1997 年;dangl建立阻力，有些其它植物防卫反应。琼斯，2001 年;琼斯dangl，2006 年）。AVR 单片机识别所受到管制机制依赖于乙烯（ET ）的 R 基因导致活化的过敏性反应（人力资源），和/或茉莉酸（JA 部）（kunkel布鲁克斯，2002 年;devoto一类程序性细胞死亡（PCD）表示，发生在或接近特纳，2003 年;洛伦索索拉诺，2005 年;穆尔等人，2006 年）。该网站的病原入境（莫雷尔 dangl ， 1999 年;希思，若干意见，导致有人认为 plant2000）。人力资源被认为是局
5、限于病原体防御反应，可进行调整，以适应攻击病原体， www.newphytologist.orgresearch132用 SA 依赖性抗辩反 biotrophs，茉莉酸和 ET 依赖性反应，代理对 necrotrophs（麦克道尔dangl，2000 年;kunkel布鲁克斯，2002 年;devoto特纳，2003 年;洛伦索索拉诺，2005 年;穆尔等人， 2006 年）。水杨酸和 JA 是相互抑制，为表达的许多基因（ kunkel布鲁克斯，2002 年;devoto特纳，2003 年; 洛伦索索拉诺，2005 年;穆尔等人，2006年）。于是几个基因，如脂肪氧化酶，pdf1 和 VSP，
6、所涉及的各个步骤的司法机构政务长讯号，是妥协公司（doares 等人，1995 年;伤害等人， 1998 年;古普塔等人，2000 年完成; spoel 等人，2003 年）。在另一方面，它也被证明司法机构政务长表示，能抑制表达酸性公关基因，是飒依赖性（和久等人， 1998 年）。突变分析，在拟南芥导致确定讯号元件下游从 R 蛋白函数（ glazebrook ， 2001 年） 。 eds1 编码一个蛋白质同源性脂肪酶，是必要的阻力（包括 HR）的介导费/白细胞介素 1 受体（跟踪）含的 R 蛋白（法尔克等人， 1999 年; peart 等人， 2002 ;胡等人， 2005 年; wier
7、mer 等人，2005 年）。其他组件不可或缺的 R 基因的功能已经确定。 sgt1 ，一个高度守恒组件所需的功能，在一定 skp1/cullin/f-box 蛋白（年次）型泛素连接酶复合物，是必不可少的功能几次的 R 基因控制心率诱导几个基因对基因系统，也非寄主防卫机制（奥斯汀等人，2002 年;金之等人，2002 年;职权范围等人，2002 年;休伯特等人，2003 年;霍尔特等人，2005 年）。两个高度同源 sgt1 基因的存在在拟南芥中，sgt1a 和 sgt1b（金之等人，2002 年，2006 年）。烟草系统研究 sgt1 是同源不可或缺的 n 依赖抗拒烟草花叶病毒（TMV），收
8、发变抗力，以马铃薯 X 病毒，与专利和商标署依赖性抵抗绿脓杆菌进行丁香 avrpto（刘等人，2002 年; peart 等人，2002b）。真菌灰霉病是一种植物病原 necrotrophic，这 colonizes 衰老或死亡的植物组织软化水果，造成灰霉病（elad，1997 年;cristescu 等人，2002 年）。真菌的菌丝可以穿透伤或自然开口的植物组织和蔓延，从以前殖民地人民死组织到健康的。灰霉病攻击不同的植物组织，并具有广泛的寄主范围（曼斯菲尔德，1980 年;elad，1997 年;贲-沙洛姆等人，2003 年）。这是采后植物产品腐烂的一个主要原因，其中包括葡萄，番茄，马铃薯，
9、草莓和烟草。因为它也能在低温下感染，它可导致重大的经济损失，在这两个采前和采后的作物（曼斯菲尔德，1980）。几个毒性因素需要其致病性上的不同寄主已被描述（法拉利等人，2003年）。灰霉病综合胞外酶降解果胶，主要组成部分和最复合多糖，在植物细胞壁，它允许其生长内植物（wubben 等人，1999 年;rha 等人，2001 年 10 有等，2001 年;cabannedoneche，2002 年;poinssot 等人，2003 年; 苏利耶等人，2003 年;卡尔斯等人，2005 年）。成功保护寄主植物对这种病菌是严重的阻碍，缺乏抗性基因在寄主相当多的表型的多样性的真菌。多项研究表明，抗药性
10、灰霉病要求司法机构政务长信令（glazebrook，2005 年）。戈夫林莱文（2000）建议该细胞死亡诱发灰霉病是一种形式的人力资源，而且这种诱导细胞死亡是一个重要的组成的毒力。进一步支持这个想法乙cinerea 的积极提倡一种形式的人力资源性细胞死亡已所提供的意见，就是抑制小时细胞死亡表达动物抗基因在转基因烟草线索，以增强抗性灰霉病（迪克曼等人，2001 年），这些数据使我们的测试是否灰霉病激活植物信号通路所需的建立人力资源，以恢复疾病。我们的研究结果显示，乙 cinerea 的启动表达了两种植物的讯号组件 eds1 和 sgt1，这是需要的HR 供养阻力。有趣的是，病毒诱导基因沉默（vi
11、gs，ratcliff 等人，2001 年;。Dinesh -库马尔等人，2003 年），这两个讯号组件增强抵抗以灰霉病，在 12 月 31 日系统研究。用稳定的转基因植物（删 pozo林，2003 年），我们还表明，表达了杆状病毒抗蛋白 p35基因，其中妥协建立人力资源，影响了疾病所造成的 necrotrophic 病原体。材料与方法植物和真菌菌株烟草系统研究的影响，烟草草。克桑西， 12 月 31 日理化变化。的 NN 和茄科番茄草。 赚钱植物生长对土壤，在生长室（达亚美实验室用品，加拿大安大略省）的 60湿度和制度下的 16 h 轻型（光合光子流密度 150 mol 光子的 M-2 秒
12、1，23/8 小时黑暗中，18C 时）。该灰霉病：神父。孤立议员 b191（b191）这是用于这项研究是由加拿大收集真菌培养（农业及农业食品加拿大，渥太华，加拿大）。真菌生长对马铃薯葡萄糖琼脂（PDA 的：马铃薯淀粉四日吉尔-1，葡萄糖 20 吉尔-1琼脂 17 克 L-1）和孵育 3 d 后，在 22。诱发产孢，板灰霉病均保持为 3 个 D ，在 22 C 时与 14 小时黑暗和 10 h 轻。分生孢子的灰霉病人收获从 sporulating PDA 的板刮它们赶走与 10 毫升蒸馏无菌水，用玻璃刮。该分生孢子被过滤 whatman miracloth 文件（calbiochem，加拿大安大
13、略省）和洗 3 次 10 毫升水中离心（3 分钟，500 克），同时注意移除所有液体从分生孢子微丸每一次，并暂停到马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）为中等。孢子然后稀释在兴盛中，以适当的浓度（106 毫升孢子-1）后，计数（ hemocytometer 细胞） 。新 phytologist （ 2007 ） 175 ： 131-139 www.newphytologist.org 。作者（ 2007 ） 。杂志汇编研究 133植物接种试验所有植物接种涉及最低的三个叶片从各三个工厂，每个试验进行了出至少3 倍。 为致病性测试和统计分析，超脱叶 4 周岁植物乃培养皿载两个印迹滤纸（ whatman，施莱歇
14、尔舒尔氏，加拿大渥太华）润湿与无菌水，然后与被检举 10 升孢子悬液（106 毫升孢子-1 的兴盛介质）或 5 毫米直径琼脂插头含有积极成长菌丝对灰霉病。培养皿，然后孵育，在 22 C 时的高湿度在玻璃托盘盖与聚乙烯包装。由分析报告，生长 4 周的植物，以孢子悬液的灰霉病（10 6孢子毫升-1 吐温 0.01）。控制植株喷吐温 0.01。植株，然后在孵育 micropropagators在 22C，较高的湿度和 16 小时黑暗 light/8-h 循环。植物样本取材于 0，6，12 和 24 h 感染后，为 RNA 提取。疾病评估这种疾病所造成的葡萄孢菌则被评定为在离体叶片 4 个 D pos
15、tinoculation ，通过测量坏死直径诱发灰霉病孢子或菌丝体插头。显微镜分析，还进行了评估感染过程中的真菌，如先前所述（ bouarab 等人，2002 年）。受感染的叶片采样 6 h 和 4 个 D 接种后，然后煮沸 1 分钟，在台盼蓝/lactophenol（10 毫升乳酸，10 克苯酚， 10 毫升甘油， 10 毫升的水，10 毫克，台盼蓝，混合 1：1 与乙醇）和 destained 为 2 个 D 在几个变化，60的甘油。该污损的组织，被认为是一个蔡司显微镜下光明-场照明（卡尔蔡司 axio 成象的 M1 摩托罗拉，魁北克，加拿大）和照片被带到一个电荷藕合器件摄像机（卡尔蔡司
16、axiocam MRC 的高分辨率彩色数位相机，13001030像素）。二部烟草手摇铃病毒（ trv ）载体和其申请沉默已被描述以前（ratcliff 等人，2001 年）。该 trvrna1 克隆是在 pbintra6，和 rna2 克隆插入的靶序列是在ptv00。矢量被要求从 Sainsbury 的实验室（诺里奇，英国）。cDNA 片段，从 12 月 31 日系统研究 sgt1（419 BP）的，或从 12 月 31 日系统研究 eds1（615 BP）的插入ptv00（ rna2），并称之为 trv：sgt1 和 trv：eds1 ，分别为（ratcliff 等人，2001 年;boua
17、rab 等人，2002 年;peart 等人，2002，2002 ）。trv：00，没有任何插入，是用来作为对照组。感染的植物与 TRV 衍生物，是由 agroinfiltration 正如前面所述（ratcliff 等人，2001 年;bouarab 等人，2002 年;peart 等人，2002，2002 ）。文化含 ptv00 衍生构造不一，与那些含有 pbintra6（rna1 ），在 3：1 的比例，然后渗透。两扩大叶片 3 周 12 月 31 日系统研究植物渗透与混合。由各级 eds1 和 sgt1 进行 RT - PCR 检测第 3 周感染后。逆转录-聚合酶链反应总 RNA 从树
18、叶中提取使用三试剂法，根据制造商的建议（西格玛 -爱秩序，圣路易斯， MO ，美国）。第一链的 cDNA 合成了 2 g 总 RNA 用标二逆转转录（Invitrogen 公司，卡尔斯巴德， CA，美国）。RT-PCR 法用引物 1（5-atggcgtccgatctggagac-3）和 2（5-ctagatctcccatttcttcagct - 3 ）扩增 sgt1 ，和底漆 3（5atggtgagaattgaagaggg-3）和 4（5-gctacctcatctgtgtgcca-3）扩增 eds1。为肌动控制扩增引物，actin1 （ 5-atggcagacggtgaggatattca-3）
19、和 actin2（5-tgcttcagtgagtagtacagggtgttc - 3 ）等方法。功放进行了一个周期，在 95 C 时为 3 分钟，30 周期的变性，在 95C 和退火在 58 C 时为 30 秒每次，伸长率在 72 C 时为 2 分钟。所有逆转录聚合酶链反应反应延长为 10 分钟，在 72 C 时，并举行了 4。结果与讨论我们很有兴趣了解植物辩护机制，对灰霉病，病原体引起的疾病在经济上重要的茄科植物如番茄和山芋。烟草和 N.系统研究已例行用作研究植物抗病机制因此，是很好的模式来分析植物病原相互作用。这促使我们调查是否有灰霉病，可感染并导致疾病的就这两个茄果类品种。我们接种灰霉病
20、（孤立 b191）叶片上的寄主番茄，12 月 31 日系统研究，并 12月 31 日理化。正如所料，孢子对孤立 b191 能感染番茄叶片通过气孔（图 1A，B）和intercellularly 在叶肉组织，然后才予以注销细胞的功能，并建立坏死病（图 1 C）。真菌引起的传播疾病病变和广泛的组织损伤（图 1）。我们观察到病轻重相似，其中 3 种植物物种（图 1，电子商务）。病毒诱导基因沉默的方法是发达12 月 31 日，为系统研究，这就使这一物种的一个具吸引力模型作进一步的分析（ ratcliff等人，2001 年; bouarab 等人， 2002 年; peart 等人， 2002 ， 20
21、02 ; 。 Dinesh -库马尔等人，2003 年）。因此，我们用 12 系统研究作为东道主调查所采用的策略，由灰霉病引起的疾病在茄果类品种。蛋白质 sgt1 和 eds1 是关键组成部分信号转导通路，导致抗病植物（法尔克等人， 1999 年;奥斯汀等人， 2002 年;金之等人，。作者（ 2007 ） 。杂志汇编。新 phytologist （ 2007 ） www.newphytologist.org 新phytologist （ 2007 ） 175 ： 131-139research1342002 年， 2006 年; bouarab 等人， 2002 年; peart 等人， 2
22、002 ， 2002 ） 。 这两种蛋白质控制心率成立了由多数已知的特定诱导物（麦克道尔 dangl ， 2000 年;达库尼亚等人， 2006 年） 。因为它已经表明，灰霉病诱使一个人力资源作为一种感染机制（戈夫林莱文， 2000 年） ，我们调查是否灰霉病利用这些人力资源 - 控制基因，以确定其疾病。本着这一目的，我们首先测试是否灰霉病规范的表达水平sgt1 和 eds1 。 4 周-老厂的 12 系统研究人喷孢子灰霉病孤立 b191 （ 106 毫升孢子- 1 吐温 0.01 ） 。植株，然后孵育在微propagators 在湿度较高，样品收获 0 ， 6 ，第 12 和 24 小时后的
23、感染。控制植物喷施吐温 0.01 。誊水平都 sgt1 和 eds1 被 RT - PCR 检测。有趣的灰霉病诱导表达水平 eds1 和 sgt1 誊本（图 2 ） 。六h 后感染，这两个基因表现出较高的转录水平， 图。一日灰霉病感染几茄果类品种。 （一）孢子从乙灰用来感染番茄（茄科番茄）叶片。 （乙，丙） ，台盼蓝染色番茄叶片感染孢子 6 小时（ b ）和 4 个 D （三） postinoculation 。后萌发，孢子穿透孔（ B 组， 箭头）和菌丝生长在间隙（三箭头） ，然后破坏细胞。 （四）感染与测试插头的灰霉病菌菌丝体对番茄和烟叶（烟草系统研究和烟草） 。 （五）疾病严重测量直径坏
24、死诱发灰霉病树叶上所示（四） 。 误差酒吧，政府统计处。图象和坏死大小录得 4 个 D postinoculation 。 图。 2 表达模式铌 eds1 和 sgt1 葡萄孢菌后， cinerea 的感染。 4 周岁烟草系统研究植物治疗 106 孢子毫升- 1 灰霉病（ 0.01 吐温）或吐温0.01 （ Control ）和样品收获，在时间点表示。总 RNA 被隔离了，并用逆转录聚合酶链反应与具体引 12 系统研究 eds1 ， sgt1 和肌动。同等数量的基因被用来作为证明所扩增与保守型肌动蛋白基因。 新 phytologist （ 2007 ） 175 ： 131-139 www.ne
25、wphytologist.org 。作者（ 2007 ） 。杂志汇编。新 phytologist （ 2007 ）研究 135 图。三沉默的两种植物讯号部件， eds1 和 sgt1 ，增强抗性烟草系统研究，以灰霉病。 （一）型低噪音植物。 （二） sgt1 和 eds1 誊水平分析 RT - PCR 检测。总 RNA 摘自鸦雀无声厂表示， 用逆转录聚合酶链反应与 sgt1 ， eds1 和actin 的引物。同等数量的基因的 cDNA 作为所表现出的扩增与保守型肌动蛋白基因。 （三，四） 感染试验，对叶片从鸦雀无声植物用插头（ c ）和孢子（四）灰霉病。 两个 10 - 升滴灰霉病孢子（ 1
26、06 毫升- 1 ）存入每个叶片的一半12 月 31 日系统研究（四） 。 （五，六）疾病严重测量直径坏死所致插头（ e ）和孢子（六）灰霉病，对叶所示（ C ， D ）的，分别为。误差酒吧， 政府统计处。图象和坏死大小记录4 个 D postinoculation 。数据集标志着一个*号的显着性差异对照组（野生型和 trv :00 -沉默厂） ，作为评核学生的 t 检验： * ， p 0.001 。 不过，虽然 eds1 表达下降至基底水平在 24 h 感染后， sgt1 表达仍然很高，在相同的时间点（图 2 ） 。以测试是否 eds1 和 sgt1 要求为疾病所造成病原 necrotrop
27、hic 灰霉病， vigs 进行了试验，其中 12 月 31 日系统研究植物分别接种烟草手摇铃病毒（ trv ）载体载有 419 名血压的 cDNA ， 12 月 31 日系统研究 sgt1 （ trv ：新加坡）或 615 基点的 cDNA 的 12 系统研究 eds1 （ trv ： eds1 ; bouarab 等人， 2002 年; peart 等人， 2002 ， 2002 ） 。控制植物接种与 trv 载体未经基因插入（ trv ： 00 ） 。后 3 周，植物受到挑战与孢子（ 10 升 106 毫升- 1 ）或插头（ 5 毫米直径） 灰霉病和疾病得分由直径的坏死区 4 个 D p
28、ostinoculation 。 trv :00 接种植物这后来被质疑与孢子和插头的灰霉病显示疾病症状相似者出产野生型植物（图在 P3C -六） 。有趣的是， 坏死病诱发孢子或插头的灰霉病是显着降低叶片的 sgt1 和 eds1 -沉默植物（图在 P3C -六） 。但是，阻力是在高sgt1 -而非 eds1 -鸦雀无声植物（图在 P3C -六） 。我们还证实 sgt1 和 eds1 誊积累减少在植物进行 trv ： sgt1 和 trv ： eds1 构建相比，分别与这两个对照组（野生型。作者（ 2007 ） 。杂志汇编。新 phytologist （ 2007 ） www.newphytol
29、ogist.org 新phytologist （ 2007 ） 175 ： 131-139research136 植物或 trv ： 00 ;图。 3B ）条。这些结果表明灰霉病利用 sgt1 和 eds1 ，有两个很重要的蛋白质，在人力资源建立，可导致疾病的植物。因此 sgt1 和eds1 ，所需的植物抗病对 biotrophic 病原体，也参与了病害的发生和发展过程疾病易感性灰霉病。 这是大家都知道动物病原体往往目标和压抑的 PCD 通路的组成部分来人为操纵其主持人。相比之下，植物病原体，往往引发的 PCD 。植物据了解，以查明致病分泌分子，以摩答辩书，其中的 PCD （人力资源）起着关键
30、作用在病原的限制。有关的 p35 蛋白杆状病毒是广泛的范围内 Caspase 抑制剂和压制的 PCD 在动物体内。 稳定表达 p35 基因在烟草造成局部的抑制作用人力资源引发的一些病原体（删 pozo 林， 1998 年， 2003 年） 。因此，感染的 p35 基因表达烟草植株（ p35q ）与烟草花叶病毒打乱氮介导的抗病性， 造成全身扩散的病毒抗背景（删 pozo 林， 1998 年， 2003 年） 。调查图。四杆状病毒抗蛋白 p35 基因妥协疾病所造成的葡萄孢菌cinerea 的。 （一）感染检测树叶上，从烟草（ Nicotiana tabacum ）植物表达杆状病毒抗蛋白质和相应的控
31、制。 （二） 疾病严重度测量直径坏死诱发灰霉病叶片表现在（一） 。误差酒吧，政府统计处。图象和坏死面积分别录得 4 个 D postinoculation 。数据集标志着一个星号是显着不同的控制（野生型）作为评定学生的 t 检验： * ，磷 0.001 。 进一步参与 HR 在建立乙cinerea 的疾病，我们测试过，这是否是真菌能感染烟草植物表达 p35 基因（ p35q ） 。作为对照，我们用野生型植物和烟草植物表达无功能p35 基因蛋白在哪一个单一的突变废除抗活性的蛋白质（ mayer 等人， 2001 年） 。超脱叶 4 周岁植株感染灰霉病插头及症状观察， 4 个 D 后感染。该结果表明，这种疾病是显着减少p35q 植物（图 4 ） 。然而，植物表达突变p35 基因蛋白（ p35mh ）更易受灰霉病相对于植物表达野生型蛋白，并表现出同样严重的感染，因为野生型植物（图 4 ） 。这些结果表明灰霉病需要细胞死亡建立以引起疾病。 传统上， sgt1 和 eds1 被视为植物信令基因妥协病（奥斯汀等人， 2002 年; 金之等人， 2002 年， 2006 年; bouarab 等人， 2002 年; peart 等人， 2002 ， 2002 ） 。在这里，我们证明了灰霉病利用这些基因
