1、, 生理科学进展 2003 年 04 期 加入收藏 获取最新 锁核酸研究进展李生茂 徐祥 梁华平 李磊 【摘要】：锁核酸 (lockednucleicacid ,LNA)是一种新型的寡核酸衍生物 ,结构中 D 呋喃核糖的 2 O ,4 C 位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥 ,呋喃糖的结构锁定在 C3内型的 N 构型 ,形成了刚性的缩合结构。LNA 作为一种新的反义核酸 ,具有与 DNA/RNA 强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。LNA 在基因诊断和基因治疗上有很多优势 ,如 :单链核酸的多态性基因分型、LNA 寡聚体具有高效抑制端粒
2、酶活性及 LNA 修饰的 DNA 核酶 (LNAzymes)高效清除高级结构的 RNA 等 ,有良好的应用研究前景【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 【关键词】： 锁核酸 核苷酸衍生物 寡聚核苷酸 【基金】： 国家重点基础研究发展规划项目(G19990 5 4 2 0 3) 国家自然科学基金( 30 170 36 7) 全军“十五”课题基金( 2 0 0 1 2 0 0 5 )资助课题 【分类号】：R341【正文快照】： 反义核酸药物是药学研究的新领域 ,
3、有希望成为分子水平治疗各种疾病如艾滋病、病毒感染、癌症、炎症反应及心血管疾病、慢性感染性疾病和遗传性疾病等新的突破口 ,正受到世界范围内的广泛重视。 1978 年 ,Zemecnik 等首先根据碱基互补配对原则 ,设计反义寡核苷酸用于基因治疗的生物化学与生物物理进展 2003 年 03 期 加入收藏 获取最新 锁核酸的特点及其应用李生茂 徐祥 梁华平 李磊 【摘要】： 【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 【关键词】：锁核酸 第三军医大学 野战外科 亚甲基
4、酸衍生物 解的稳定性 治疗各种疾病 寡核苷酸 热稳定性 呋喃核糖【分类号】：R341【正文快照】： 近期 ,锁核酸 (lockednucleicacid ,LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研究领域引起了人们的广泛关注 ,有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口 .它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物 ,结构中含有一个或多个 2 O ,4 C 亚甲基 D 呋喃核糖核酸单体 ,核糖的 2 O 位当前位置: 首页 期刊 中国现代医生 2010 年第 11 期 正文编号:11899111 应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中 K-ras 基因突变(2)http:/ 2010 年 4 月 15 日 章
5、伟 钟 翔 夏献颗1.2.5 测序 对 SSCP 发现有异常片段的 DNA 随机抽取进行正反双向 DNA 测序。同时针对 LNA 探针检测有突变的 PCR 产物进行克隆后测序确认。2 结果2.1 LNA 探针检测和 PCR-SSCP 检测及测序结果应用 LNA 探针荧光 PCR 方法检测,对照组样本均未发现 K-ras 基因 12 密码子突变。85例组织样本中,25 例胃癌组织样本检出 10 例突变(40%),28 例直肠癌样本中检出 13 例突变(46.4%),22 例结肠癌样本中检出 11 例突变(50%),10 例胰腺癌样本 6 例检出突变(60%)。97例肿瘤血浆样本中,30 例胃癌血
6、浆样本检出 8 例有突变(26.7%),32 例直肠癌血浆样本检出 11例有突变(34.4%),25 例结肠癌血浆样本检出 12 例有突变(48%),10 例胰腺癌血浆样本 5 例检出突变(50%) 。随机测序结果表明 LNA 探针检测突变正确。突变型 LNA 探针检测结果如图 1 所示。应用 PCR-SSCP 方法检测 ,对照组样本均未发现 K-ras 基因 12 密码子突变。85 例组织样本中,25 例胃癌组织样本检出 9 例突变(36%),28 例直肠癌样本中检出 11 例突变(39.3%),22例结肠癌样本 8 例检出突变(36.4%),10 例胰腺癌样本 5 例检出突变(50%) 。
7、97 例肿瘤血浆样本中,30 例胃癌血浆样本检出 6 例有突变(20%),32 例直肠癌血浆样本检出 8 例有突变(25%),25 例结肠癌血浆样本检出 11 例有突变(44%),10 例胰腺癌血浆样本 4 例检出突变(40%) 。随机测序结果表明 SSCP 方法检测突变正确。PCR-SSCP 检测结果如图 2 所示。2.2 LNA 探针 -荧光 PCR 法检测敏感性将 12 密码子突变型 K-ras 质粒(102107) 拷贝/ L与一定量的 12 密码子野生型 K-ras质粒按一定比例(1:1、1:10、1:100 、1:1000 、1:10000)混合 ,然后进行荧光 PCR 反应,结果
8、LNA 探针检测可以稳定地检出突变型 K-ras 质粒为 10 拷贝 ,检测的灵敏度为 1:1000。3 讨论近年来,K-ras 基因突变的检测被作为肿瘤诊断和治疗预后的一项重要指标,在临床实验室中已经广泛开展,应用的方法也较多,检测的样本主要包括肿瘤组织样本、血浆及粪便等2-6。既往研究表明7-9, 现有一些方法存在灵敏度差等问题,同时也不利于高通量样本同时进行检测,所以发展出更为快速、简便并且非常敏感的 K-ras 基因检测方法,对临床意义重大 .中国期刊资讯网 论文库 医学论文 临床医学论文 应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中 K-ras 基因突变应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中 K-ra
9、s 基因突变 2010-06-06 11:13 来源: 作者： 网友评论 0 条 浏览次数 185 摘要 目的 应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中 K-ras基因突变,探讨其诊断价值。方法 结合锁核酸 TaqMan 探针与实时荧光 PCR 技术建立 K-ras 基因突变快速检测法,与传统聚合酶链反应-单链构象多态性分析法 ( PCR-SSCP)及测序结果进行比较,评价新方法的诊断价值。结果 锁核酸探针 PCR 法可对肿瘤样本中 K-ras 基因突变进行有效检测,操作简便;可在 104 倍的野生型 K-ras 基因背景下检测出突变,灵敏度为 0.1%,可检测突变基因最低限为 10 拷贝/ mL,相
10、对应传统方法,本方法可同时进行较大规模的样品检测,更快捷和灵敏。结论 锁核酸探针实时荧光 PCR 法较 PCR-SSCP法有明显优势,适用于大规模临床样本的 K- ras 基因突变检测,可作为肿瘤筛查和预后判断有效手段。 关键词 锁核酸; K-ras; 荧光 PCR; PCR-SSCP 中图分类号 R730.4 文献标识码 A 文章编号 1673-9701(2010)11-86-03 近期,锁核酸(locked nucleic acid,LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物引起了人们的广泛关注。由于LNA 和核苷酸在结构上有很大的相似性,故其对 DNA、RNA 有很好的识别能力和强大的亲和力。与
11、其它寡核酸类似物相比,LNA 有很多优点 ,如和 DNA、RNA 互补的双链有很强的热稳定性,Tm 值可升高 38;具有抗 3脱氧核苷酸酶降解的稳定性 ;高效的自动寡聚化作用,合成方法简单等1。K-ras 基因的突变与胃癌、胰腺癌、结直肠癌密切相关,结、直肠癌患者 K-ras 点突变率达 40%50%, 且点突变几乎皆位于 12,13 和 61密码子,其中大多数突变点位于 12 密码子。本研究即通过 LNA 探针荧光 PCR 方法检测肿瘤样本和血浆中K-ras 基因的突变,了解 LNA 探针检测方法的优越性。 1 材料和方法 1.1 临床资料 收集本院肿瘤组织样本 85 例,其中胃癌组织样本
12、25 例,直肠癌样本 28 例,结肠癌样本 22 例,胰腺癌样本10 例。收集肿瘤血浆样本 97 例,胃癌血浆样本 30 例,直肠癌样本 32 例,结肠癌样本 25 例,胰腺癌样本 10 例。所有患者均经手术、病理证实。另取 20 例正常人样本为对照组。 1.2 方法 1.2.1 取材 肿瘤组织样本为术中切取新鲜肿瘤组织 1cm1cm1cm,立即放入-80 冰箱储存备用。抽取肿瘤患者外周静脉血 5mL,以 EDTA 抗凝,1000g 离心,提取血浆储存于-80冰箱中备用。 1.2.2 DNA 提取 取 1g 冷藏的肿瘤组织浸入液氮中,待组织结冻,将其捣碎,置入研钵中,加入少许液氮,研磨至粉末状
13、。应用 QIAamp DNA Mini Kit 进行组织样本中 DNA 提取。将冷藏的血浆自然解冻后,应用QIAamp MinElute Virus Spin Kit 进行血浆样本中 DNA 提取。 1.2.3 LNA 探针-荧光 PCR 检测 针对 K-ras 基因位于 12 密码子的突变点,应用 Premier Biosoft International 公司 Beacon Designer7.0 软件设计引物和探针。PCR 反应总体积为 50L,Qiagen公司 Hot-Star热启动酶 1.5U,KCl 和(NH4)2SO4 混合缓冲液,MgCl 25.0mM,dNTPs 0.2mM,
14、引物浓度 200nmol/L,探针浓度为 150nmol/L,其中突变型 LNA 探针用 FAM 标记,野生型 LNA 探针用 HEX 标记,淬灭基因都用 BHQ1,模板5L。反应条件为 95 15min 热启动;94变性 30s,55退火 45s,共 45 循环。应用 ABI7500 进行扩增反应和荧光信号检测。 1.2.4 PCR-SSCP 应用 Primer Primier5.0 设计 K-ras 基因 12 密码子突变扩增引物 PCR 反应总体积为50L,Qiagen公司 Hot-Star 热启动酶 1.5U,KCl 和(NH4)2SO4 混合缓冲液,MgCl 21.5mM,dNTPs
15、 0.2mM,引物浓度 200nmol/L,模板 5L。反应条件为 95 15min 热启动;94变性 30s,55退火 30s,72延伸 30s,共 35循环。应用 ABI9700 PCR 仪进行扩增反应。应用 Bio-Rad 公司垂直板电泳仪进行 PCR 产物变性后电泳,对电泳胶进行银染。 1.2.5 测序 对 SSCP 发现有异常片段的 DNA 随机抽取进行正反双向 DNA 测序。同时针对 LNA 探针检测有突变的 PCR 产物进行克隆后测序确认。 2 结果 2.1 LNA 探针检测和 PCR-SSCP 检测及测序结果 应用 LNA 探针荧光 PCR 方法检测,对照组样本均未发现 K-r
16、as 基因 12 密码子突变。85 例组织样本中,25 例胃癌组织样本检出 10 例突变(40%),28 例直肠癌样本中检出 13 例突变(46.4%),22 例结肠癌样本中检出11 例突变(50%),10 例胰腺癌样本 6 例检出突变(60%)。97 例肿瘤血浆样本中,30 例胃癌血浆样本检出 8 例有突变(26.7%),32 例直肠癌血浆样本检出 11 例有突变(34.4%),25 例结肠癌血浆样本检出 12 例有突变(48%),10 例胰腺癌血浆样本 5 例检出突变(50%)。随机测序结果表明 LNA 探针检测突变正确。突变型 LNA 探针检测结果如图 1 所示。 应用 PCR-SSCP
17、 方法检测,对照组样本均未发现 K-ras 基因 12 密码子突变。85 例组织样本中,25 例胃癌组织样本检出 9 例突变(36%),28 例直肠癌样本中检出 11 例突变(39.3%),22 例结肠癌样本 8 例检出突变(36.4%),10 例胰腺癌样本 5 例检出突变(50%)。97 例肿瘤血浆样本中,30 例胃癌血浆样本检出 6 例有突变(20%),32 例直肠癌血浆样本检出 8 例有突变(25%),25 例结肠癌血浆样本检出 11 例有突变(44%),10 例胰腺癌血浆样本 4 例检出突变(40%)。随机测序结果表明 SSCP 方法检测突变正确。PCR-SSCP 检测结果如图 2所示
18、。2.2 LNA 探针-荧光 PCR 法检测敏感性 将 12 密码子突变型 K-ras 质粒(102107)拷贝/ L与一定量的 12 密码子野生型 K-ras 质粒按一定比例(1:1、 1:10、1:100、1:1000、1:10000)混合,然后进行荧光 PCR 反应 ,结果 LNA 探针检测可以稳定地检出突变型 K-ras 质粒为 10 拷贝,检测的灵敏度为 1:1000。 3 讨论 近年来,K-ras 基因突变的检测被作为肿瘤诊断和治疗预后的一项重要指标,在临床实验室中已经广泛开展,应用的方法也较多,检测的样本主要包括肿瘤组织样本、血浆及粪便等2-6。既往研究表明7-9,现有一些方法存
19、在灵敏度差等问题,同时也不利于高通量样本同时进行检测,所以发展出更为快速、简便并且非常敏感的 K-ras 基因检测方法,对临床意义重大。 本研究将锁核酸探针技术和实时荧光 PCR 技术结合,与传统的 PCR-SSCP 方法进行比较,同时对检测的结果进行测序验证,结果发现新建立的方法具有灵敏度高的特点,可以一次反应把野生型和突变型完全分开;同时由于直接闭管操作,减少了配胶、电泳以及测序等过程,使得检测程序变得极为简便易行,也最大限度地减少了污染的可能性,降低假阳性率。最后检测的灵敏度可达 0.1%,检测突变的最低拷贝数可到 10 拷贝/mL。 综上所述,本实验提供了一种快速、敏感的 K-ras
20、基因突变检测方法,应用此方法进行 K-ras 基因检测有望成为肿瘤筛查和预后判断的有效手段;而且通过对 LNA 探针的广泛应用,该方法也能够用于检测其他基因的缺失或插入突变。 参考文献 1 Koshkin AA,Rajwanshi VK,Wengel J,et al. Novel convenient syntheses of LNA2.2.1 bicyclo nucleosidesJ. Tetrahedron Lett,1998,39:4381- 4383. 2 Tada M,Komatsu Y,Kawabe T,et al. Quantitative analysis of K-ras g
21、ene mutation in pancreatic tissue obtained by endoscopic ult rasonogra- phy-guided fine needle aspiration:clinical utility for diagnosis of pancreatic tumorJ. Am J Gast Roenterol,2002,97:2263-2270. 3 陈积贤,黄建武,张洁,等. 胃癌患者门静脉血中 p53 和 K-ras 基因突变的检测及其临床意义J. 中华普通外科杂志,2006,21(10):739- 741. 4 Boadas J,Mora J
22、,Urgell E,et al. Clinical usefulness of K-ras gene mutation detection and cy2tology in pancreatic juice in the diagnosis and screening of pan2creatic cancerJ. Eur J Gast Roenterol Hepatol,2001, 13:1153-1159. 5 Mora J,Urgell E,Farr A,et al. Agreement between K-ras sequence variations detected in plas
23、ma and tissue DNA in pancreatic and colorectal cancerJ. Clin Chem,2006,52:1448-1449. 6 Sawabu N,Watanabe H,Yamaguchi Y,et al. Serum tumor markers and molecular biological diagnosis inpancreatic cancerJ. Pancreas,2004,28:263-267. 7 Leon S A,Shapiro B,Sklaroff D M,et al. Free DNA in the serum of cance
24、r patient s and the effect of therapyJ. Cancer Res,1977,37:646-650. 8 Haug U,Hillebrand T,Bendzko P,et al. Mutant-enriched PCR and allele-specifichybridization reaction to detect K-ras mutations in stoolDNA: high prevalence in a large sample of older adultsJ. Clin Chem,2007, 53:787-790 9 Castell SA,
25、Puig P,Mra J,et al. K-ras mutations in DNA extracted from the plasma of patients with pancreatic carcinoma:diagnostic utility and prognostic significanceJ. J Clin Oncol,1999,17:578-584. 接：http:/ JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY2007 Vol.27 No.11 P.977-982锁核酸捕获 TaqMan 探针实时 PCR 和 PCR-RFLP检测乙型肝炎病毒
26、基因变异的研究余文辉 周小梅 周大桥 李顺民 贺劲松 李爱娣 摘 要：目的 评价锁核酸捕获 TaqMan 探针实时聚合酶链反应(PCR)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测乙型肝炎病毒(HBV)基因变异的特点.方法 分别用直接测序法、锁核酸(LNA)捕获TaqMan 探针实时 PCR 和 PCR-RFLP 检测 77 例接受拉米夫定(LAM)治疗 6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本.结果 锁核酸捕获 TaqMan 探针实时 PCR 和 PCR-RFLP 都能检测 HBV 野生型 YMDD 及其变异型 YIDD 和YVDD.此外,两种方法尚能鉴定 HBV 野生型和变异
27、型混合种群.更为重要的是,在检测 HBV 野生型和变异型共生变异方面,锁核酸捕获 TaqMan 探针实时 PCR 比 PCR-RFLP 更敏感、更省时.结论 锁核酸捕获 TaqMan 探针实时 PCR 是一种检测 HBV YMDD 变异的灵敏度和特异性都高的快速法,在监测 HBV 患者 LAM 抗病毒治疗的疗效及发现新耐药病毒基因型等方面具有广泛的应用前景.关键词：聚合酶链反应;YMDD 基因;乙型肝炎病毒;变异;限制性片段长度多态性;锁核酸Gene mutations of hepatitis B virus were detected by locked nucleic acid-medi
28、ated TaqMan probes real-time PCR and PCR-RFLPYU Wen-hui ZHOU Xiao-mei ZHOU Da-qiao LI Shun-min HE Jing-song LI Ai-di 基金项目：深圳市科技计划项目(200603200)作者简介：余文辉,Email:,电话:0755-82057319 通讯作者 作者单位：余文辉（518033,深圳市中医院） 周小梅（518033,深圳市中医院） 周大桥（国家级肝病重点专科） 李顺民（518033,深圳市中医院） 贺劲松（国家级肝病重点专科） 李爱娣（518033,深圳市中医院） 参考文献：1徐静,
29、闻玉梅.乙型肝炎病毒基因分型及其意义.肝脏,2005,10(4):306-308.2Bowden S,Bartholomeusz A,Locarnini S.Lamivudine resistant occult HBV:implications for public health? J Hepatol,2003,38(4):526-528.3Stuyver LJ,Locarnini SA,Lok A,et al.Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase re
30、gion.J Hepatol,2001,33(3):751-757.4Hong SP,Kim NK,Hwang SG,et al.Detection of hepatitis B virus YMDD variants using mass spectrometric analysis of oligonucleotide fragments.J Hepatol,2004,40(5):837-844.5Suzuki N,Yoshida A,Nakano Y.Quantitative analysis of multi-species oral biofilms by TaqMan Real-T
31、ime PCR.Clin Med Res,2005,3(3):176-185.6李生茂,徐祥,梁华平,等.锁核酸的特点及其应用.生物化学与生物物理进展,2003,30(3):400.7Letertre C,Perelle S,Dilasser F,et al.Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5-nuclease PCR assays.Mol Cell Probes,2003,17(6):307-311.8Kennedy B,Arar K,Reja V,et al.Locked nucleic acids for op
32、timizing displacement probes for quantitative real-time PCR.Anal Biochem,2006,348(2):294-299.9Johnson MP,Haupt LM,Griffiths LR.Locked nucleic acid (LNA)single nucleotide polymorphism(SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR.Nucleic Acids Res,2004,32(6):e55.10李雅娟,庄辉,李杰,等.特异性引物聚合酶链反应乙
33、型肝炎病毒基因分型法的建立及应用.中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(9):859-862.11陈发林,郭永建,伍严安,等.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒 YMDD 变异的研究.中华检验医学杂志,2006,29(11):980-983.收稿日期：2006 年 12 月 13 日出版日期：2007 年 11 月 30 日学术期刊 广东医学 2011 年 1 期 锁核酸探针实时荧光定量 PCR 检测 HBV 基因变异 锁核酸探针实时荧光定量 PCR 检测 HBV 基因变异摘要： 目的 描述并评价锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光定量聚合酶链反应 (
34、real-time PCR)检测乙型肝炎病毒(HBV)204 位基因突变的方法及特点.方法 分别用直接测序法、LNA 探针实时荧光定量 PCR 检测 109 例接受拉米夫定(LAM)治疗 6 个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本.结果 LNA 探针实时荧光定量 PCR 能检测 HBV 野生型 YMDD 和其突变型YVDD、 YIDD,而且这种方法还可以检测 HBV 野生型和变异型的混合.LNA 探针相比普通探针在检测野生型和突变型混合样本方面更敏感,区分度更好.结论 LNA 探针实时荧光定量 PCR 检测 YMDD 变异具有快速、灵敏等特点,可以用于大量临床样本的快速筛查,在监测拉米夫定治疗疗
35、效及发现新耐药突变型等方面具有广泛的应用前景.作者： 江洁 丁渭 陈华云 何琼 何蕴韶 作者单位： 江洁(中山大学中山医学院基础医学院,广州,510080)丁渭,陈华云,何琼,何蕴韶(中山大学达安基因股份有限公司 ,广州,510665)期 刊： 广东医学 ISTICPKU Journal： GUANGDONG MEDICAL JOURNAL 年，卷(期) ： 2011, 32(1)分类号： R4关键词： 锁核酸探针 荧光定量 PCR YMDD 乙型肝炎病毒 拉米夫定耐药突变 机标分类号： R44 R73机标关键词： 核酸探针 实时荧光定量 PCR 检测 荧光定量聚合酶链反应 野生型 突变型 慢
36、性乙型肝炎患者 拉米夫定 LNA 乙型肝炎病毒 血清样本 方法 nucleic acid 直接测序法real-time HBV 治疗疗效 应用前景 特点 基因突变 基金项目： 国家科技部 863 计划项目参考文献(16 条) 1. TRANH T T;PAWESTRI H A;NGOC N M A real-time RT-PCR for detection of clade 1 and 2 H5N1 influenza A virus using locked nucleic acid(LNA) TaqMan probes 外文期刊 2010 DOI:10.1186/1743-422X-7-
37、46 2. SINGH S K;NIELSEN P;KOSHKIN A A LNA(locked nucleic acids):synthesis and high-affinity nucleic acid recognition 1998 3. SIMEONOV A;NIKIFOROV T T Single nucleotide polymorphism genotyping using short,fluorescently labelled locked nucleic acid(LNA) probes and fluorescence polarization detection 外
38、文期刊 2002(17) DOI:10.1093/nar/gnf090 4. LATORRA D;CAMPBELL K;WOLTER A Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3 locked nucleic acid(LNA) primers 外文期刊 2003(01) DOI:10.1002/humu.10228 5. VESTER B;WENGEL J LNA(locked nucleic acid):high-affinity targeting of complementary RNA
39、and DNA 外文期刊 2004(42) DOI:10.1021/bi0485732 6. BMASCH D A;COREY D R Locked nucleic acid(LNA):fine-tuning the recognition of DNA and RNA 2001(01) 7. KOSHKIN A A;RAJWANSHI V K;WENGEL J Novel convenient synthesis of LNA2.2.1bicyclo nucleosides 1998(24) 8. ALLEN M I;DESLAURIERS M;ANDREWS W Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine.Lamivudine Clinical Inestigation Group 外文期刊 1998(06) DOI:10.1002/hep.510270628 9. 姚光弼;王宝恩;崔振宇 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎 2 年临床试验的总结 2000(03) 10. 任永强;胡大荣;范公忍 HBV P 基因 YMDD 变异的检验及临床应用的研究 期刊论文 -胃肠病学和肝病学杂志 2005(01)
