1、1灭菌/无菌工艺验证指导原则（第二稿）目录1 概述 .22 制剂湿热灭菌工艺 .32.1 湿热灭菌工艺的研究 .32.1.1 湿热灭菌工艺的确定依据 .32.1.2 过度杀灭法的工艺研究 .32.1.3 残存概率法的工艺研究 .32.2 湿热灭菌工艺的验证 .32.2.1 物理确认 .32.2.2 生物学确认 .33 制剂无菌生产工艺 .33.1 无菌生产工艺的研究 .33.1.1 无菌分装生产工艺的研究 .33.1.2 过滤除菌生产工艺的研究 .33.2 无菌生产工艺的验证 .33.2.1 培养基模拟灌装试验 .33.2.2 除菌过滤系统的验证 .34 原料药无菌生产工艺 .34.1 无菌原
2、料药生产工艺特点 .34.1.1 溶媒结晶工艺 .34.1.2 冷冻干燥工艺 .34.2 无菌原料药工艺验证 .34.2.1 验证批量 .34.2.2 最差条件 .321 概述无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药品应完全不含有任何活的微生物，但由于目前检验手段的局限性，绝对无菌的概念不能适用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌” 。一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（Sterility Assurance Level,
3、 SAL）来表征。而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。无菌药品通常的灭菌方式可分为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizing process）和无菌生产工艺（aseptic processing） 。其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。部分
4、或全部工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药的生产中比较常用的湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指导原则中的湿热灭菌工艺验证主要包括灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确认等内容；无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统的验证等验证内容。最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率10 -6，非最终灭菌无菌产品的无菌保证水平至少应达
5、到95%置信限下的污染概率0.1%。由此可见，非最终灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术设备。基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌保证水平符合要求，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的3灭菌方式，并系统地评估生产的各环节及各种因素对无菌保证水平的影响，根据风险的高低与风险发生的可能性等来针对性地验证灭菌工艺的可靠性，验证的内容、范围与批数等取决于工艺与产品的复杂性以及生产企业对类似工艺的经验多少等因素。只有在研发中经过系统而深入的研究与验证，获得可靠
6、的灭菌工艺，并在日常的生产过程中严格执行该工艺，才能真正保证每批药品的无菌保证水平符合预期的要求。当然，在药品的整个生命周期内，随着对所生产的药品的特性和生产工艺等的了解越来越全面和深入，灭菌工艺也在不断的完善，此时就会涉及到对变更后的工艺如何进行验证的问题，本指导原则也适用于此种情况。由于灭菌/除菌工艺验证的工作在我国开展的时间不长，基础还不牢靠，因此必然在实际工作中会遇到很多难以预料的问题，故本指导原则只是一个一般性原则，药物研发者应从药物研发的客观规律出发，具体问题具体分析，必要时根据实际情况采用其他有效的方法和手段。同时，本指导原则作为阶段性产物，必将随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研
7、究与验证的认知加深，而不断进行修订与完善。2 制剂湿热灭菌工艺2.1 湿热灭菌工艺的研究2.1.1 湿热灭菌工艺的确定依据灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树（详见附件 1）进行，湿热灭菌工艺是决策树中首先考虑的灭菌工艺。湿热灭菌法是利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。高温在杀灭微生物的同时，可能对药品的质量也有所影响。如果产品不能耐受湿热灭菌，则需要考虑采用无菌生产工艺。所以，对于药品的灭菌工艺的考察和确定，首先是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌的高温。目前湿热灭菌方法主要有两种：过度杀灭法（F 012）和残存概率法（8F
8、012）。用其它 F0值小于 8 的终端灭菌条件的工艺，则应该按照无菌生产工艺要求。以上两种湿热灭菌方法都可以在实际生产中使用，具体选择哪种灭菌方法，4在很大程度上取决于被灭菌产品的热稳定性。药物是否能耐受湿热灭菌工艺的高温，除了与药物活性成分的化学性质相关外，还与活性成分存在的环境密切相关，所以在初期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析，以确定能否采用湿热灭菌工艺。2.1.1.1 活性成分的化学结构特点与稳定性通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性，如果活性成分结构中含有一些对热不稳定的结构基团，则提示主成分的热稳定性可能较差。在此基础之上，还应该通过设
9、计一系列的强制降解试验对活性成分的稳定性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下可能发生的降解反应，以便在处方工艺的研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺。2.1.1.2 处方工艺的研究在对活性成分的结构特点与稳定性进行研究的基础上，可以有针对性的进行处方工艺的优化研究。如活性成分易发生氧化反应，则需要考虑是否需要在工艺中去除氧并采取充氮的生产工艺，或在处方中加入适宜的抗氧剂；如活性成分的稳定性与 pH 值相关，则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性的 pH 值，当然此时需要关注该 pH 值在临床治疗时能否接受；如果主成分是因为某些杂质的存在影响了稳定性，则需要通过适宜的手段去除
10、相关的杂质；如果是主成分在某种溶剂系统中稳定性较差，则需要考虑更换溶剂系统，此时同样需要考虑所选用的溶剂系统在临床应用时能否被接受；湿热灭菌的不同灭菌温度和灭菌时间的组合对产品的稳定性的要求有所不同，可以在保证提供所需的 SAL 的基础上，通过灭菌时间和灭菌温度的调整来确定药物可以耐受的湿热灭菌工艺。总之，需要通过各个方面的研究，使药物尽可能的可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论和实践均证明即使采用了各种可行的技术方法之后，活性成分依然无法耐受湿热灭菌的工艺时，才能选择无菌保证水平较低的无菌生产工艺。2. 2.1.3 稳定性研究无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。考察最终灭菌
11、程序对产品性质稳定性影响的试验可包括产品的降解、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品的其它质量特性。5灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却的变化将影响产品的稳定性，同时影响杀灭效果。因此，稳定性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条件的产品，如：可采用在热穿透试验中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保灭菌产品的质量仍能符合要求。2.1.2 过度杀灭法的工艺研究通常来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需的被灭菌品开始生产阶段和日常监控阶段生物负荷的信息较少，但是过度杀灭要求的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的可能性增大。过度杀灭法的目标是确
12、保达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌产品初始菌的数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121值大于0.5分钟。因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，从技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循 GMP 的要求，这一点是可以实现的。2.1.3 残存概率法的工艺研究与过度
13、杀灭法相比，残存概率法方法所需的信息量要大得多，包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段的信息、指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验菌）以及生物负荷的信息。只有积累了这类有价值的信息后，才能制定比过度杀灭法F 0值低的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。使用热力较低灭菌程序更有利于药品的稳定性，使产品的有效期延长。正是因为这个原因，残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。通常说来，不耐热药品的灭菌可能不能使用过度杀灭法，需要设计一个灭菌程序能够恰当地杀灭生物负荷，同时不导致产品不可接受的降解。这种情况下，灭菌程序的确认就需研究产品的生物负荷和耐热性。根据以下公式可以比较清楚的
14、说明这一点：无菌保证值= F 0 / D - lgN06其中，无菌保证值是 SAL 的负对数，N 0为灭菌开始时产品中的污染微生物总数，D 为污染微生物的耐热参数。所以，菌工艺的无菌保证值与 F0、N 0、D 密切相关。2.1.3.1 灭菌前生物负荷的控制采用残存概率法进行终端灭菌的产品，除了需要关注灭菌过程本身，还需要在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体的措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等等。灭菌前微生物污染水平的监测将在下面的章节详细阐述。产品过滤在终端灭菌的产品中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺确定的过程中，也应该对滤
15、膜的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物的特性，通常在药液放置期间也会逐渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有利于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放置的最长时限，并相应确定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。2.1.3.2 灭菌前微生物污染的监测灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，如果灌装持续一段时间，可从每批产品灌装开始、中
16、间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下的方法：先用灭菌的 5%吐温充分湿润 0.45um 的滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营养琼脂平板上，在 3035 下培养 37 天，计数。分离获得的污染菌需要进行耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用以下的测定方法：先用灭菌的 5%吐温充分润湿 0.45um 的滤膜，然后过滤污染水平监测所取的药液样品，再将此膜移至装有无菌的待监测产品的试管中，在沸水浴上煮沸约 30 分钟，然后在 30-35下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观察是否有耐热菌生长。当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定时煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，
17、可再测试耐热污染菌的 D 值7（D 值的具体检测方法详见附件 2） ，然后根据灭菌的 F0值及污染菌的数量与耐热性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。2.2 湿热灭菌工艺的验证湿热灭菌工艺的验证一般分为物理验证和生物学验证两部分，物理验证包括热分布、热穿透试验，生物学验证主要是微生物挑战试验。物理验证是证实灭菌效果的间接方式，而微生物挑战试验则直接反映灭菌的效果，两者不能相互替代。2.2.1 物理确认2.2.1.1 空载热分布试验空载热分布的目的是主要是了解整个灭菌设备的运行情况，确认灭菌室内的温度均匀性，测定灭菌腔内不
18、同位置的温差状况，确定可能存在的冷点。空载热分布试验通常采用足够数量的热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室的不同位置。温度探头的安放位置需要根据设备类型和不同位置下的灭菌风险评估而定，应包括可能的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处，其他的探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度的检测具有较好的代表性。温度探头在试验前后至少需要两个温度点进行校正。温度探头安放结束后，即可以按照设定的灭菌程序进行灭菌。2.2.1.2 装载热分布试验装载热分布试验的目的是了解设备在装载条件下内部的温度分布状况，包括高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。装载热
19、分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安放的位置一般同空载热分布试验，注意一定要在空载热分布试验确定的冷点安放温度探头。温度探头安放在待灭菌的容器的周围，注意不能介入待灭菌的容器。装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，进行试验时，应尽可能使用待灭菌产品，如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等进行适当的风险评估。待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用图表的方式说明产品的装载情况，并评估探头放置是否合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采用的样品和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。每一装载量8的
20、热分布试验需要至少进行三次。温度探头在试验前后同样均需要进行校正。2.2.1.3 热穿透试验热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌产品适用性的一项试验。热穿透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度。对于药物而言，灭菌程序既要赋予产品一定的 F0值，以保障产品的 SAL10 6 。同时灭菌程序又不应使产品受热过度而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均一。热穿透试验所用的温度探头的个数和安放位置需要根据热分布试验的结果确定。一般可以采用足够数量的温度探头。应将热穿透温度探头置于液体容器中的冷点，即整个包装中最难灭菌的位置。如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也
21、能够反映出产品的热穿透情况，风险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。插有温度探头的产品的安放位置包括热分布试验确定的冷点和高温点、其他可能的高温点、灭菌柜温度探头附近、温度记录探头处。热穿透试验的步骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方式的热穿透试验也需要至少进行三次。通过热穿透试验可以确定在设定的灭菌程序下，灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够到达设定的温度。结合灭菌前微生物污染的检测，可以确定灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够获得设定的 F0值。对于 F0值最大点位置的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没
22、有影响。2.2.1.4 热分布和热穿透试验数据的分析处理 在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。通常需要关注的主要参数包括- 每个探头所测得温度的变化范围- 不同探头之间测得的温度变化范围- 探头测得的温度与设定温度之间的差值- 探头测得超过设定温度的最短及最长时间- F0 的下限及上限9- 灭菌阶段结束时的最低F 0值- 灭菌阶段的最低和最高压力- 饱和蒸汽温度和压力之间的关系- 灭菌阶段腔室的最低和最高温度- 热穿透温度探头之间的最大温差或F 0 的变化范围- 热分布试验中温度探头间的最大温差- 最长平衡时间- 最少正常运行的探头数合格标准应结合灭菌条件、灭菌设
23、备的特点以及产品的实际情况制定。通常情况下，灭菌柜腔室最冷、最热点和平均温度之间的温差应不超过 2.5。保温时间内温度波动应在1.0之内，如果温度差别过大，提示灭菌柜的性能不符合要求，需要寻找原因并进行改进，重新进行验证。另外对于热敏感的药物，还应该控制灭菌柜的升温和降温时间，以保证热能的输入控制在合理的范围以内，不会对产品的热稳定性造成影响。2.2.2 生物学确认湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将一定量已知 D 值的耐热孢子（生物指示剂）在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能达到产品所需的标准灭菌时间和 F0。此项验证工作能够如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证
24、明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。2.2.2.1 生物指示剂选用的一般原则一般情况下，生物指示剂选择的原则性要求是：孢子稳定、非致病菌、易于培养、有效期长、保存及使用方便、安全性好。针对具体的灭菌工艺和具体的产品，还应注意所用的生物指示剂的耐热性应强于待灭菌产品中的污染菌。湿热灭菌工艺常用的生物指示剂有以下几种，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌等。对于采用过度杀灭法的灭菌程序，生物指示剂系统主要是嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子 。残存概率法由于其热输入量比较低，因此在验证中使用的生物指示剂的耐热性可以小于嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。102.2.2.2 生物指示
25、剂的使用和放置实际验证过程中可以直接采用市售的生物指示剂成品或将生物指示剂接种在待灭菌产品上。采用市售品时，只要供应商具有相应的质量体系认证资质，在测试中其提供的生物指示剂的 D 值就可以被接受。采用将生物指示剂接种到待灭菌产品的方法，由于生物指示剂在不同介质或环境中的耐热性会有所不同，首先应考虑产品对生物指示剂耐热性的影响。所以对于具体的品种而言，如果需要将生物指示剂接种至产品之中，应测定生物指示剂在该产品中的耐热性，即 D 值。如果生物指示剂与产品不相容，可以用与产品相似的溶液来代替产品。生物指示剂的用量需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐热性来确定，其用量应符合挑战性试验的要求。生物指示
26、剂的用量可以采用阴性分数法或者残存曲线法计算，可以根据实际情况（如污染菌的耐热性，拟用的生物指示剂的 D 值等）选择合适的计算方法，具体检测方法见附件 3。应结合产品特点和热分布、热穿透的实际结果来确定生物指示剂的放置位置。装有生物指示剂的容器应紧挨于装有测温探头的容器，在灭菌设备的冷点处必需放置生物指示剂。灭菌柜的其他部位应装载产品或者类似物，以尽可能的模仿实际生产时的状况。2.2.2.3 灭菌生物指示剂的验证应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。2.2.2.4 检查和培养可以根据生物指示剂的生长特性以及验证时的包装方式，采用适当的方法进行检查和培养。将指示剂放入培养基中进行培养。需要注意不同的生物指示剂所需要的培养条件也各不相同，针对使用的生物指示剂确定培养条件，同时应放置阴性和阳性对照样品。2.2.3.5 试验结果的评价根据生物指示剂的 D 值和接种量推算产品在灭菌过程中实际达到的 SAL 值。验证新的灭菌工艺时，每个产品的每个规格的每一灭菌程序，至少需要连续进行三次生物指示剂验证试验。如果试验的重现性好，所有试验的结果均提示SAL10 -6，则验证结果提示该灭菌工艺为验证合格的灭菌工艺。如果各次验证的结果不一致，需要分析原因，采取相应的改进措施后重新进行验证工作。
