1、苯酚降解菌 2,3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析一 摘要：环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。目前环境监测常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。苯酚广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。含酚废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数微生物所分解。在油田地层水中分离出苯酚降解菌 BF80，并且从 BF80 中克隆出编码 2， 3-邻苯二酚双加氧酶(参与苯酚降解所必须的一种酶 )的基因序列；采用基因克隆的策略是
2、通过 PCR 进行片段克隆，并用 UNIQ-10柱形 DNA 回收试剂盒回收产物，采用 NCBI BLAST 序列分析表明该基因片段长 1207bp,序列比较分析表明该基因片段与 2-苯酚羟化酶 A 相似度达 88%，氨基酸序列分析表明其与 2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达 96%。本实验研究编码降解苯酚的 2,3-邻苯二酚双加氧酶的基因克隆及序列分析，为构建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基础。Phenol degrading bacteria 2 - phenol hydroxylase gene sequence analysisAbstract:Phenol pollution in t
3、he environment mainly refers to phenolic compounds on water pollution, waste water containing phenol is usually turned around the highest levels of phenol and cresol. Often present environmental monitoring such as phenol and cresol Phenol as pollution indicators. Phenol widespread in the petroleum,
4、chemical, gas, coke, steel and phenolic wastewater plant emissions. Phenolic wastewater emissions of water pollution, poisoned fish, damage crops, and a serious threat to human health, water pollution control in China has been a key to solve one of the harmful waste. The toxicity of phenol organics
5、still only a small number of micro-organisms, their decomposition.In oilfield water of phenol degrading bacteria isolated from BF80, and BF80 was cloned from the 2,3 - catechol dioxygenase (involved in phenol degradation of an enzyme necessary) of the gene sequence; using gene cloning strategy were
6、cloned by PCR, with UNIQ-10 column DNA extraction kit recycling products, using NCBI BLAST sequence analysis showed that the gene fragment was 1207bp, Sequence analysis showed that the gene fragment and 2 - A similarity to phenol hydroxylase 88% amino acid sequence analysis showed that with 2,3 - ca
7、techol dioxygenase similarity of 96%. This study coded degradation of phenol 2,3 Catechol Dioxygenase Gene Cloning and sequence analysis, in order to build efficient genetic engineering of bacteria degrading phenol basis关键词： 苯酚 苯酚降解菌 基因克隆 基因序列分析 二、前言苯酚俗名石炭酸，无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味（与浆糊的味道相似） 。置露空气中或日光下被氧化逐渐
8、变成粉红色至红色，在潮湿空气中，吸湿后，由结晶变成液体。酸性极弱（弱于） ，有特臭，有毒，有强腐蚀性。环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，含酚废水是当今世界上危害大、污染范围广的工业废水之一，是环境中水污染的重要来源。在许多工业领域诸如煤气、焦化、炼油、冶金、机械制造、玻璃、石油化工、木材纤维、化学有机合成工业、朔料、医药、农药、油漆等工业排出的废水中均含有酚。这些废水若不经过处理，直接排放、灌溉农田则可污染大气、水、土壤和食品。目前对含酚废水的处理方法主要以下五种，一、吸附法 ，利用一些多孔吸附剂较高的比表面积表现出的较强的吸附性能将废水中的酚类物质吸附,吸附剂吸附饱和后可再生使用,
9、酚类物质也可以回收利用。常用的吸附剂主要有活性炭、磺化煤、大孔吸附树脂及有机合成吸附剂等。此种方法的最大优点是设备简单、操作方便、净化效率高、吸附量大及吸附选择性高等。活性炭吸附虽然吸附量大,但再生困难,因而其使用逐渐不为人们看好。磺化煤的吸附容量较小，处理后废水中含酚量远达不到排放标准，需进行二级处理。所以活性炭和磺化煤在处理高浓度含酚废水时受到了一定的限制。二、萃取法， 萃取法主要是利用难溶于水的萃取剂与废水接触,使废水中的酚类化合物在从水相转移到溶剂相中,从而达到酚类物质与水分离的目的。根据目前回收与处理含酚废水的技术水平和经济核算的结果,对于浓度高于 1000/的高浓度含酚废水 ,采取
10、溶液萃取工艺,不失为一种经济高效的处理方法。三、液膜分离技术 ， 液膜分离技术和溶剂萃取过程相似，也是由萃取与反萃取两个过程构成的。但是在液膜分离过程中，萃取与反萃取是同时进行，一步完成的。其传质速率明显提高，甚至可以实现溶质从低浓度向高浓度的传递。四、气提及蒸馏气提法 ，气提法是根据挥发性酚类化合物与水蒸气形成共沸化合物,四、气提及蒸馏气提法利用酚在两相中的浓度差将酚水分离,从而使水得以净化。高浓度的含酚废水可用气提法处理,去除率在 80%85%。此种方法可回收酚,效率高,操作简单,但对不挥发性酚不能使用。五、生物法，对于高浓度的含酚废水来说，生物法的处理效果不是很好，但是随着生物新技术的发
11、展，近来用生物法处理高浓度含酚废水也有一些报道。应用包埋法固定化微生物技术处理废水是废水处理的新技木。经固定化酶和固定化微生物普遍比未固定化的微生物性能好，稳定、降解有机物能力强、耐毒、抗杂菌，耐冲击负荷。在生物法当中，苯酚降解菌扮演着重要角色，目前国内外有关苯酚降解菌的分离及分离物多样性分析，以及苯酚降解菌的分离鉴定及其苯酚降解特性分析的研究已见诸报道；另外也有对于外界条件对嗜热菌 BF80生长及苯酚降解的影响研究，但对参与编码苯酚降解过程的各种酶的基因的研究目前尚少见报道。苯酚降解菌是一种能有效降解苯酚的微生物目前对该类微生物的种类研究尚不清晰，有报道用富集培养和直接涂平板培养的方法,从含
12、酚废水处理系统的悬浮污泥中分别分离了 57 株和 55 株苯酚降解菌（参见文献 1） 。蝙蝠 80 苯酚降解菌，是苯酚降解菌的一种，有研究表明 Ca2+和 Mg2+对嗜热菌 BF80 生长有促进作用，二者对嗜热菌 BF80 的最大苯酚降解率几乎没有影响，但 Ca2+降低其降解速率，而 Mg2+可提高嗜热菌 BF80 的苯酚降解速率；05%浓度的酵母粉最适合 BF80 的生长，可使其最大生长量达到 1563（参见文献 2-3） ，本次试验展开对嗜热菌 BF80 苯酚降解菌研究，获得对编码该菌降解苯酚所需的酶基因的序列和氨基酸序列进行分析，为其对苯酚降解机理提供依据。三、材料与方法1、嗜热菌 BF
13、80 由油田地层水中分离得到 ；2、菌种活化：取 BF80 菌苔一环于 20ml 于 LB 液体培养基中，振荡培养 24h，离心分离菌体，用生理盐水洗涤 2 次，悬于 10ml 的生理盐水中3、用 SDS 裂解法大量制备菌株 BF80 总 DNA；4、设计引物：根据GanBank 数据课公布的序列设计二对兼并引物一、二（表 1） ；5、对基因片段进行 PCR 以获得目的片段；（1）PCR 反应体系：PCR 反应体系由生工提供的 50 微升体系：Taq 酶（0.25微升） ，dntp（10mmol/l）,Mg2+（25mmol/l）,boffer（15 微升） ，引物 1（1 微升） ，引物 2
14、（1 微升） ， 去离子水（36.75 微升）（2）PCR 程序：变性温度 95；退火温度 50、30s；复性温度 72、10min，共 30 个循环；40无限循环；（3） ；PCR产物的检测：用0.9% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物大小及其特异性（结果显示于图1） ；PCR产物回收（UNIQ-10柱形DNA回收试剂盒回收产物）6、将目的片段连接到载体并转化入大肠杆菌（1）以E.coilDH5a 作为DNA操作时用的受体菌；（2）感受态细胞的制备液氮或低温冰箱中取出大肠杆菌 DH5a，在 LB 平板上划线。37 摄氏度过夜至全长出菌落；挑直径 1-3mm 的单菌落多个，接种到 250ml
15、锥形瓶的 SOB 培养基培养基不可再多，会影响效率； 在 18、150-250r/min 培养 19-50 小时（没有冷却的药床可在室温进行），温度不可超过 37； OD600 约 0.4-0.8 时培养放在冰水中冷却 10min； 在 4 摄氏度、300r/min 离心 15h,回收菌体； 去掉上清后用 1/3 体积的冷 TB 溶液悬浮，冷 10min； 再次离心回收菌体； 用 1/12.5 体积的 TB 悬液添加最终浓度为 7%的 DMSO 再冷却 10min； 0.121ml 分装，直接在液氮上冻； 在液氮或-80保存。（3）用大肠杆菌克隆载体 PGEM-T-Easy（载体大小为 450
16、bp,含有抗性）（4）连接载体体系由宝生物提供：10 微升体系，PMD-19-T 0.5 微升，solution2.5 微升 DNA4.5 微升 16连接过夜。（5） 、转化（1）冰上融化感受态 E.coilDH5a,2min；（2）混匀连接产物和感受态 E.coilDH5a，以上两个步骤在 30min 完成；（3）42冰浴 50s(4)冰上放置 5min；(5)混匀转化产物并用 1mlLB 培养基培养于 37、180r/min、1h;(6)离心 10min,、1200 r/min，倒掉上清液，残留 100 微升；(7)涂板 37平板 30min,倒置培养，过夜后对其进行观察；7、重组菌的筛选
17、（1）蓝白斑筛选培养基；（2）将上述通过转化过程的 E.coilDH5a 于蓝白斑培养基涂板培养，一段时间后，观察记录；8、选择白斑处的 E.coilDH5a 进行菌落 PCR；9、质粒酶切的鉴定；10、电泳检测11、DNA 测序，结果见表 2。四、结果与分析1、兼并引物的设计：（表 1）CLONE1（ORF3986-5191）TY0029 UP：5-CCATTGTGGATCAAGGAGG-3TY0030 DOWN：5-GTCAGCATAACTCATATAG-3CLONE2(ORF4542-5665)TY0047 UP:5-G CCGATACGGCAGGAATG-3TY0048 DOWN:5-
18、 AGCCTCATCCAAGGCCGG-32、PCR结果：（表2、图1）PCR获得两条DNA链分别为1125bp和207bp（如图1） ，将两条相邻的DNA 片段拼接如下！ TTCCAAAACCGATTAAGTCTGGCGCTATACAATCAAATCCTTTTTCGTTGAAAAATGGAAGCGCATATTGCCAATTAGACCAAGCGGTGGCTCCTGGACCAGACCCATGGATAAAAAGAATCGCTTTACTATTCCCGATACCGGCGCGGTAAAAATATGTCTCATAGTCTCCGGTTTTGACACGGGTACTCGTCACTTCTTGCAAACTAGACT
19、ACCTCCCATCGAACGCGGATAGCGAAT TTTTCAAAGTTACACCTAATAGCAACTTTTTCCTTAAGCATTGTTAGTTCAAAAAGGGGCCAGTAGACAGAAGCCCCTTGATTCTTTTTTACGTTAATGCTTTAGAGAATGATTCAACTAGTTCTCTTCGATGATAGAAGATGCCTGTTCCAATTTTATCTTCCGTCCATGTAATGGTCGGGAAGTCAGCATAACTCATATAGCCGCTCGCGAATGCCTCGTTTCTATTTCCGGATGGGT CAAAGAAGTAAATGGTTTGGCCGCGTGTGAT
20、TCCATGCCGGGTCGGTGTAATTTCGACTTGAACATCGTTTTTTGTTAAAATATCCGCTGCTTTCAATACTTCGTACCAATTGTCTACATAAAATCCTGCATGGTGGAATTTCCCATCTGGTCCTTTCACGAAAGCGACGTCATGGGCTTTATTAGTCACTGACAAAAAGCTGCCGACTAAATCTTCCCCATCTACCGTAATGATCCTCT CTGTTTGTCTAAAACCGAGCACTTCCGTAAAGAAGCGGGTGGCTGTTTTCAAATCATCGCCTGTTAAAAGAGCGTGATCCAATCGATGTG
21、GAGCAATTCCTTTTAGTCCATCCGGCCATGGATGCGGGTTGATATGCCCCGTCTTTGTCCCTACTTGTTCGATGTCAGTATATAGCTCCATATAATGACCTGTAGGAAGCTGGAAACGAACTGCTTCTCCTTCTGCTAATCTAGCGCCTT TGGAAATCCGGGAAAGTGTGCATCCAAATTGTTCAATTTTATATTCTAATTTTTCCAACTCGTAAATATCTTTTACCTTAAATGCCATATGATCCATTCCTGCCGTATCGGCTTTTTGCAAAATGATGCTGTGATGGTCGTATTCGTCC
22、CACGCTTTTAAATACACTCGGTCTTCTTCGCGCCCTGTCACTTCAAGTCCAATGACATCCGTATAATATTTTACAGATTCTTCTAAATCCA ATACCCGAAGTTCCAATCGTCCCAGTCTTAAAATTCCGCTCATTTGAATCCTCCCTTTTATTGAAAGATTTTATTTATGAAATGAAATCGATGCAAAAACGCTTTCTATCAAACCGCTTCCAATAAGGATAGCGCCGCTTCGCAACACATCCGGTCTTCTTCTTCTGAGCCGCCGCTGACTCCAATCCCTCCAGCTAAATCTTTTCCG
23、TCATAAATCGGATAACCGCCTCCGAAAATGAC AAGCTTTTCTGTATGGACAATCCCAAGGCGCAAACTCGGCTCATCCTTGATCATGTCATACCATTGATGGGTTGGAATCCCGAAAGCCGCCGCCGTATACGCTTTATTTTGCGCTATTTGTATGCTTAAAAGGGGAGCACCATCCATCCGGCAAAACGCTTTCAAGTTT翻译的蛋白质序列如下：MSGILRLGRLELRVLDLEESVKYYTDVIGLEVTGREEDRVYLKAWDEYDHHSIILQKADTAGMDHMAFKVKDIYELEKLEYKIEQFG
24、CTLSRISKGARLAEGEAVRFQLPTGHYMELYTDIEQVGTKTGHINPHPWPDGLKGIAPHRLDHALLTGDDLKTATRFFTEVLGFRQTERIITVDGEDLVGSFLSVTNKAHDVAFVKGPDGKFHHAGFYVDNWYEVLKAADILTKNDVQVEITPTRHGITRGQTIYFFDPSGNRNEAFASGYMSYADFPTITWTEDKIGTGIFYHRRELVESFSKALT 3、Blast 对比结果如下：基因片段与 2-苯酚羟化酶 A 相似度达 88%，氨基酸序列分析表明其与 2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达 96%。说明该酶可能既具有
25、 2,3-邻苯二酚双加氧酶又具有 2-苯酚羟化酶 A 的作用，图 1 （53 ）以下游为准的方向， “47-48”（共 1125）与“29-30 ”， （共 1207bp）的 PCR 结果4、重组菌株的筛选蓝白斑筛选：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段，其中有 -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到 -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码 -半乳糖
26、苷酶 C 端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为 -互补。由 -互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无 -互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板 37温箱倒置培养 12-16hr 后，
27、有重组质粒的细菌形成白色菌落。五、小结与结论BF80 属于 Geobacillus theim oglucosidasius,是最近才发现的降解苯酚的嗜热菌，能在高温下和较广的 PH 值范围内能保持较好苯酚降解能力，,其最适生长和降解苯酚的温度为 6065。利用 API50CHB/E 系统和 16SrDNA 序列分析对菌株 BF80 进行了分类鉴定,该菌株的形态和生理生化特性与Geobacillusthermoglucosidasius 基本相同,其 16SrDNA 序列与GeobacillusthermoglucosidasiusBGSCW95A1(=ATCC43742)的相似性为 9922
28、%。在接种量为 1%的条件下,该菌在 20h 内能完全降解 3mmol/L的苯酚;在 pH 值 5590 范围内能保持对苯酚良好的降解能力,并在12mmol/L 苯酚的无机盐培养基中也能生长和降解苯酚,表明该菌能耐受高浓度苯酚并可用于高温含酚废水的生物处理（参考文献 5） 。在参与降解苯酚的多个基因中，2，3-邻苯二酚双加氧酶是其中的关键基因之一，本实验通过对2，3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析的研究，可以表明编码该酶的基因约 bp(见表 1)，通过 NCBI Blast 的比对可以说明该基因片段与 2-苯酚羟化酶A 相似度达 88%，氨基酸序列分析表明其与 2,3-邻苯二酚双加氧酶相似
29、度达 96%。说明该酶可能既具有 2,3-邻苯二酚双加氧酶又具有 2-苯酚羟化酶 A 的作用，但是对于苯酚降解的具体过程以及各种关键酶的作用还有待进一步的研究。参考文献：1、含酚废水处理系统中苯酚降解菌的分离及分离物多样性分析 ，陈敏; 方序 杭州师范大学生命与环境科学学院; 浙江省微生物研究所 【文献出处】 环境科学学报,Acta Scientiae Circumstantiae,编辑部邮箱,2009 年 05 期 【DOI】 CNKI:SUN:HJXX.0.2009-05-0082、一株高效苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究嗜热菌 BF80 处理含酚废水的工艺研究唐赟 杨峰晓 刘亮 齐
30、赛飞 ;3、不同碳氮源对嗜热菌 BF80 生长和降解苯酚的影响 ，杨峰晓 唐赟， 西华师范大学学报(自然科学版) ，2008 年 第 02 期4、金属离子对嗜热菌 BF80 生长及苯酚降解的影响研究杨峰晓 ; 唐赟 西华师范大学生命科学学院; 西华师范大学生命科学学院 南充 637002; 南充 6370025、一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性 唐赟 ; 刘沐之; 梁凤来; 冯露; 刘如林 ，南开大学生命科学学院 ; 南开大学生命科学学院; 南开大学生命科学学院; 南开大学生命科学学院; 南开大学生命科学学院 天津 300072; 西华师范大学生 命科学学院; 南充 637002; 天津 300072; 天津 300072; 天津300072; 天津 3000726、氯粘康酸环异构酶基因克隆及序列研究,钟文辉 何国庆(南京师范大学化学与环境科学学院 南京210097)(浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310029)孙 明 喻子牛 冯孝善(华中农业大学生命科学技术学院武汉430070)(浙江大学环境与资源学院 杭州 310029
