1、第三章 基因工程载体,第一节 克隆载体第二节 表达载体第三节 特殊用途载体,DNA： 1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。,载体 （Vectors）,定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。,载体 （Vectors）,运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复
2、制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体的功能,目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体 。,（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。,（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。,基因工程对载体的要求,（7）具有较好的安全性，不能任意转移。,（2）有选择性标记 Ampr、Tetr、Kanr等。,（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。,（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。,（6）具有对受体细胞的可转移性。,大肠杆菌质粒载体 pBR322结构图,复制起点,遗传标记基因,克隆位点,克隆位点,载体 的种类,按功能分类 克隆载体克隆
3、一个基因或DNA片断 表达载体用于一个基因的蛋白表达 整合载体把一个基因插入到染色体组中 按来源分类 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体,载体的种类和特征,第一节 克隆载体,1. 质粒载体（plasimid vectors）2. 噬菌体载体（phage vectors）3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）,质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制,的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等） 。,质粒的生物学特性,（1）质粒
4、的概念,差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。 质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。,（2）质粒的大小,（3）质粒的生存,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个
5、拷贝),（4）质粒的自主复制性,因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。,两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。,（5）质粒的不相容性,（6）质粒的可转移性,在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。,Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。,Non Conjugative plasmid 非接合型质粒（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配对和自我转移的基因，质粒不能从一
6、个细胞自发的转移到另一个细胞。,基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。,即mob基因的产物可打开非接合质粒的bom 位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。,大肠杆菌接合（conjunction）,（7）携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,定义
7、:在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因 1. 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 2. 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,遗传标记基因,标记基因的作用,1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HI
8、S4等。 3. 生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ， GUS，CAT 4. 噬菌斑,标记基因的种类,质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。,双螺旋共价闭合环（超螺旋）,开环双螺旋（一个裂口）,线状双螺旋（两个裂口）,（8）质粒的存在形式,质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,天然质粒的局限性,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,人工
9、组建的质粒 人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表构建的一系质粒的编号。,质粒载体的命名原则,第一阶段（1977年前）天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子
10、载体，表达型载体及各种探针型载体。,质粒载体的发展概况,质粒载体的构建,5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件,质粒构建基本策略,1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化体,2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组,3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量,4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝,7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单,1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS,2、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、PCR,3、组装合适的选择标记基因,4、选择合适的启动子,5、提高外源DNA的容量,6、需要灭活初始质粒上的某些编码基因,质粒构建原则,质粒载体：
11、作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因 温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,质
12、粒载体的分类,（1）高拷贝数的质粒载体,ColE1、pMB1、pMB9 松弛型质粒。,具有低分子量、高拷贝数的优点。具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数10003000个！,用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。,质粒载体的分类,（2）低拷贝数的质粒载体,由pSC101派生来的载体。特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等,适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。,（3）温控的质粒载体,一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2,温度低（40 oC），拷贝数很快增加到1000个。,（4） 插入失活型质粒载体,载体的克隆位点位于其某一
13、个选择性标记基因内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。,如pDF41、pDF42、pBR322。,抗生素抗性,外源DNA,无抗生素抗性,（5）正选择的质粒载体,可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。,质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。,经典的大肠杆菌质粒载体,pSC101质粒载体,天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。9.09 kb。四环素抗性Tetr。,ColE1,天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，6.6Kb。,有氯霉素扩增效应，每个细胞1000-3
14、000拷贝,选择标记,大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）,colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成噬菌斑。, colicin E1基因的结构,cea,imm,kil,结构基因,免疫基因,溶菌基因, 杀死不含有ColE1细菌的原因,cea + kil基因产物, 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因,imm基因,EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。,EcoR I,唯一的克隆位点,用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作
15、选择，操作非常繁杂。,pBR322：,p:质粒；BR：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322：实验编号,人工构建载体,三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124: AmprpSC101: Tetr,pSC101,氨苄青霉素和四环素抗性,24个单一克隆位点。,9个导致Tetr基因失活,3个会导致Ampr基因失活,pBR322的优点, 双抗生素抗性选择标记,抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体质粒的有效方法，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。,获得重组载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,Amp,AmpTet,不含质粒载体,含
16、有空质粒载体,含有重组质粒载体,pBR322重组克隆的筛选 重组克隆的 “插入失活”筛选方法 pBR322插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长； pBR322插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。,氯霉素扩增之后，每个细胞可 10003000copies, 安全,失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。, 高
17、拷贝数, 分子小，克隆能力大,长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源DNA片段。,具有较多的单一酶切位点（24种）,保留了转移蛋白（mob）的作用位点。,pBR322的缺点,能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！, 删除mob识别位点,（如质粒pBR327、pAT153等）。,pAT153：,从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。,PBR322的改进,pBR325：,在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。,
18、使EcoRI 也成为插入失活型位点。, 改造EcoR I 位点,pUC系列载体,在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,（1）元件来源,c. lacz基因：大肠杆菌lac操纵子DNA区段，编码-半乳糖苷酶-肽链，是LacZ氨基端的一个片段.载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。d. MCS 多克隆位点。,a .ori来自pBR322质粒的复制起点,b. 标记基因（ampr）:pBR322的Ampr基因,（2）克隆位点,具有MCS（多克隆位点）区段：位于lacZ基因的5端。10个连续的单一限制酶切位
19、点，但它不破坏该基因功能。,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导lacz所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段（肽）的合成。 x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal 蓝色,菌落蓝白选择的原理：,-互补：pUC类载体带有lacz基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（-肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称-互补。,菌落蓝白斑选择的原理：在基因克隆时，细菌在含有IPTG和xgal的培养基中进行培养。 IPTG诱导质粒的lacz基因产生-
20、肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使xgal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz失活，不能表达-肽，破坏了互补作用，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。,互补显色反应,PUC载体的优点：,a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝,b 具有MCS片段，可把具有两种不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC类载体上。,c 可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑筛选）.,pGEM载体,总长度为2743bp含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个l
21、acZ编码基因一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。,pGEM系列与pUC系列之间的主要差别,pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于Lac z基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM
22、-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。 这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状 通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.,穿梭质粒载体,用Taq酶的PCR产物3端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。 再生TA克隆载体的方法：,克隆载体的线性化,克隆载体末端补平,克隆载体末端加T,TA载体,pMD-T 载体,
