1、1.1 光镊技术简介光镊是以激光的力学效应为基础的一种物理工具，是利用强会聚的光场与微粒相互作用时形成的光学势阱来俘获粒子的【4】 。1969 年，A. Ashkin 等首次实现了激光驱动微米粒子的实验。此后他又发现微粒会在横向被吸入光束（微粒的折射率大于周围介质的折射率） 。在对这两种现象研究的基础上，Ashkin 提出了利用光压操纵微粒的思想，并用两束相向照射的激光，首次实现了对水溶液中玻璃小球的捕获，建立了第一套利用光压操纵微粒的工具。1986年，A. Ashkin 等人又发现，单独一束强聚焦的激光束就足以形成三维稳定的光学势阱，可以吸引微粒并把它局限在焦点附近，于是第一台光镊装置就诞生
2、了【5，6】 。也因此，光镊的正式名称为“单光束梯度力势阱 ” （single-beam optical gradient force trap） 。由于使用光镊来捕获操纵样品具有非接触性、无机械损伤等优点，这使得光镊在生物学领域表现出了突出的优势。这些年来，随着研究的深入和技术的不断完善，光镊在生物学的应用对象由细胞和细胞器逐步扩展到了大分子和单分子等。目前，光镊常被用来研究生物过程中的细胞和分子的运动过程【7-10】 ，也常被用来测量生物过程中的一些力学特征【11-14】 。1.2 光镊的原理与特点众所周知，光具有能量和动量，但是在实际应用中人们经常利用了光的能量，却很少利用光的动量。究其
3、原因，这主要是因为在生活中我们接触到的自然光和照明光等的力学效应都很小，无法引起人们可以直接感受到或观察到的宏观效应。而科学家们利用激光所具有的高亮度和优良的方向性，使得光的力学效应在显微镜下显现了出来，在这里我们要介绍的光镊技术正是以这种光的力学效应为基础发展起来的。1.2.1光压与单光束梯度力光阱光与物质相互作用的过程中既有能量的传递，也有动量的传递，动量的传递常常表现为压力，简称光压。1987 年，麦克斯韦根据电磁波理论论证了光压的存在，并推导出了光压力的计算公式。1901 年，俄国人 .列别捷夫用悬在图 1.1 单光束梯度力光阱细丝下的悬体实现了光压的实验测量【15】 。此后，美国物理
4、学家尼克尔、霍尔也分别测量了光压【16】 。20 世纪 70 年代，人们开始研究激光的辐射压力，并发展了原子束的激光偏转【17】 、激光冷却【18】 、光子粘团【19】等实验技术。在宏观微粒的光压力研究方面，由光悬浮发展到光捕获、光致旋转等【20】 。1970 年，A.Ashkin【21】首次实现了水溶液中的光悬浮。随后的一些研究【22-25】最终导致了光镊的发明。通常光对物体的作用力都是推力。但是，在一定条件下光也可以对物体产生拉力，或更一般的，产生束缚力。这就牵涉到光对物体作用的梯度力。为了阐明梯度力的概念，以透明介质小球为例说明。如图 1.1 所示，一个透明介质小球处于一个高斯分布的非均
5、匀会聚光场中，小球的折射率大于周围介质的折射率。当会聚激光束照射到微粒上时，激光发生折射和反射，也包括一部分吸收。被微粒反射和吸收的光作用就是光辐射压力，或者称散射力，其方向与光传播方向一致，它趋向于使小球沿光束传播方向运动。与此同时，光束经过微粒会发生多次折射，有些会聚光线折射后传播方向更趋向于光轴（即光束传播方向） ，从而增大了轴向动量，因而给与微粒与光传播方向相反的作用力，表现为拉力，这就是轴向梯度力的本质，由于此拉力的作用，导致粒子在轴向可以稳定在激光焦点附近。而微粒在横向的偏离，由于光场的非均匀性，也会受到指向激光焦点的回复力，即横向梯度力。在梯度力和散射力的共同作用下，微粒被稳定束
6、缚在激光焦点附近。这就是单光束梯度力光阱。1.2.2光镊技术的特点光镊是对单光束梯度力光阱的形象的称呼，因为它与宏观的机械镊子具有相似的操控物体的功能。但与宏观的机械镊子相比，或者与传统的操控微纳米粒子的显微微针或原子力显微镜等相比，光镊具有不可比拟的优越性。光镊对微粒的操控是非接触的遥控方式，不会给对象造成机械损伤。这使得光镊在生物学研究特别是单细胞单分子研究领域应用非常合适。首先，光镊捕获微粒的尺度在几十纳米到几十微米，正好是生物细胞、细胞器以及生物大分子的尺度范围。其次，光镊的温和操控不会损失细胞，虽然激光会产生热，但可以通过选择合适的波长，避开细胞对光的吸收波长，将热效应降到最低。另外
7、，由于大部分细胞膜是透明的，光可以穿过细胞膜操控细胞内部微粒，这是其他操控手段无法做到的。光镊不仅可以操控微粒，还可以进行微小力的测量，粒子偏离捕获中心的距离和其受到的回复力成正比，类似与弹簧，在操控过程中能实时感应俘获粒子的微小负荷。因此，光镊是极其灵敏的力传感器，其作为微小力的探针，可以进行细胞和生物大分子之间的相互作用的定量测量，进一步揭示细胞的功能以及活动规律。3.2 单个光镊的光路设计在我们设计的纳米光镊系统中将配备多个光镊。而每个光镊的光路设计都遵循相同的设计要求。即激光束从光源出射开始，到通过物镜形成光镊，中间所经过的耦合光路，要保证物镜输出的光束会聚度最大、像差最小，形成的光镊
8、捕获效果最好。为此要求物镜后瞳能被光束完全充满，以便提高光镊捕获性能。本节以 HeNe 激光光镊为例，详细讨论单个光镊的光路设计。图 3.2 为 HeNe 激光光镊的光路简图。我们采用的倒置显微镜的光路为无穷远系统，因此激光进入物镜后瞳时应是平行光束。显微镜中有个固定在镜体内的透镜焦距 150mm 的辅助透镜 T。它必须作为光镊系统中的一部分参与到光图 3.2：HeNe 光镊光路示意图路设计中。为了得到尽可能大的激光束会聚度，即油浸物镜数值孔径 NA 所许可的最大会聚角度，激光器输出的光束必须被扩束，以满足耦合光路对光束直径的要求。当物镜像侧的孔径（后瞳）被高斯光束恰当地照明时，光束将会被聚焦
9、为衍射极限的焦斑。物镜出射光束的理想会聚角度 为 126 度，由可得理想束腰 为 363nm。001.270本装置中使用了一个 （如图 3.2,由透镜 L1 和 L2 组成）扩束器。HeNe1激光器发出的激光束直径为 0.65mm，经过扩束后光束直径为 6.5mm。该光束被焦距 250mm 的透镜 L3 会聚到物平面的共轭面 C（该平面的位置为显微镜左侧的CCD 接收靶面的位置）上，然后通过 CCD 通道进入显微镜，被 45 度二向色反射镜反射，再经过辅助透镜 T 后，变换为合适直径的平行光束进入物镜 O 的后瞳，在物镜的物平面形成会聚点，在该点附近形成了光镊。在实际光路的设计中，除了要保证物
10、镜后瞳被光束充满，我们还需要考虑下列情况：阱位与焦点位置并不一致。为了保证被捕获的微粒能够清晰成像到观测平面上，激光束经过物镜后的会聚点应适当偏离物平面，而使阱位落在物平面上。通常被捕获微粒的比重大于周围液体，因此要求阱位也即物平面在焦点之内。上面描述的光路和元件参数就是基于这样的考虑，经过实验测量确定的。我们改变了光路中 HeNe 光束的扩束情况，使激光束经过扩束镜后并不是平行光束，而透镜 L3 和辅助透镜 T 之间的距离也被改变，并不严格等于该两枚透镜的焦距之和。最后到达物镜后瞳处的激光束并不平行，光斑直径约为 6mm，稍大于物镜后瞳（5mm） 。光束的焦点落在物平面之外，保证了被捕获样品
11、的清晰成像。保证了被捕获样品的成像状态和光镊的捕获性能，并且由于进入物镜后瞳的光斑稍大，这就使得当入射激光束有少许偏转的时候，物镜后瞳依然能保持充满，光镊性能受到的影响较小。出于光镊光路调整的需要，也是为了在必要时对阱位作横向调节，光路中还插入了两个可进行俯仰、左右二维调整的反射镜。同样，必要时可通过对扩束镜中透镜位置的纵向（激光传播方向）调节实现光镊阱位在纵向的移动，这些将在后文中进行详细介绍。3.3 多光镊的光路设计在多光镊系统的设计中，耦合光路要能地将多个光镊有机地耦合在一起，而不影响它们的独立操控。目前所使用的多光镊装置，可以分为两大类。第一， 单光镊的分时复用：这种方式是在单光镊的基
12、础上，在光镊中加入一个光学扫描部件，使单光镊依次反复在多个位置间进行快速的切换 7，8 。每一个位置都按次序使用激光光源的一个时间片段。例如：光镊在初始位置捕获一个微粒，然后迅速地切换位置，在另一个位置抓住第二个微粒。按这种方式，当光镊经过若干位置后，重又回到原来的位置，只要切换速度足够快，第一个微粒还没有来得及脱离光镊捕获区域，因此又会被重新稳定在捕获位置。如此反复即实现了光镊的分时复用。这种方式的机械复杂度较高，使用的时候在光镊扫描的路线上都可以实现捕获，即可以实现多个微粒的捕获；微粒间的距离不易准确控制，不易实现光镊间相对的复杂操作。第二， 多光束实现多光镊：这种方法思路简单，每个光镊都
13、由独立的光束形成。实现方法主要有如下几种：1对某一激光束进行分束，可以是能量分束或偏振分束。能量分束是将激光束按照能量比例分成多束。不过由于它们来源于同一激光束，分束后的激光具有好的相干性，容易发生干涉，对光捕获不利。偏振分束是将激光束分成偏振方向互相垂直的二束光 5 。这种方法简单易行、能量损耗低，得到的二束偏振光之间无干涉效应，并且也可以通过光学器件对分束后两束偏振光的能量比进行连续调节。该方法形成的双光镊稳定，但最多只能形成两个光镊；2对同一激光束作位相变换，使激光束波前形成所需要的分布，最后可以在光场内形成多个光镊 9，10 。目前已有科研人员采用液晶位相变换器实现了多光镊 11,12
14、 ，光镊数量可以达到上百个。这种方法适应范围广，但代价较高；3用多个激光器形成多个光镊，即采用不同波长的激光器。这对光学器件镀膜的要求较高，而且增大了光路的复杂度，因此不宜采用过多的不同波长激光。我们采用偏振分束和不同波长激光两种方法相结合来实现三光镊装置。图3.3 为设计简图。作为基本设置，三个光镊既可以协同实现单个刚性微粒在空间的准确定位与定向；也可以用二个光镊操控一线形大分子、第三个光镊操控单个微粒，研究它们间的相互作用；也可以独立操控三个微粒，研究它们的相互作用。三个光镊可以同时操作，也可以相对操作，它们的相互配合能够实现各种复杂的操作组合，足以满足实际应用中的不同需求。 （在设计上也
15、为今后扩展为具备更多个光镊的系统作了考虑。 ）我们研制的纳米光镊装置使用了波长 632.8nm 的 HeNe 激光和波长为 810nm的半导体激光二种不同波长的激光源。HeNe 激光形成的光镊主要用于定量测量，通常是固定不动的。其光路已在前小节讨论，这里不再赘述。另二个光镊由同一个半导体激光器输出的激光经偏振分束后的双光束分别形成。激光束先经过一个可连续旋转的 810nm 的半波片，以调节光束中两个互相垂直的线偏振分量的相对强弱，即可通过旋转该半波片改变分束后双光束的功率比。然后激光束被偏振分束棱镜（PBS1）分成水平偏振和垂直偏振两束线偏振激光。这两个光束经过各自的光路，在第二个偏振分束棱镜
16、（PBS2）处汇合为一束光。将第二块偏振分束棱镜用作光束的合成器的好处是，可以将这两束偏振方向相互垂直的线偏振激光几乎无能量损失（除了在一些界面上的反射损失）的汇合进一个光路之中。然后双光束在二向色镜处与 HeNe 激光束汇合。二向色镜反射 810nm 的激光，透射 632.8nm 的激光。上述三束激光一起经过辅助透镜 T 后，变换为平行光束进入物镜 O 的后瞳，由同一物镜分别形成三个光镊。每个光镊都可以实现对微米尺度粒子的捕获与操纵。3.4 三维操控图 3.3：多光镊光路简图光镊最基本的操控是对被捕获微粒的定位和沿一定轨迹以一定速度的拖动，实际上就是对光镊阱位的操控。作为光镊操控系统的设计，
17、首先要解决的问题就是根据实际应用的需要，选择合适的操控方式和驱动方法，实现对光镊阱位的灵活控制。对于我们研制的多光镊装置，还要考虑各光镊操控的独立性和相互配合的问题，即实现它们相对整个装置的运动和它们之间的相对运动，以便完成各种复杂的操作动作。3.4.1 操控方式和驱动方法通常有二种不同的操控方式来实现粒子与周围环境之间的相对运动。一种是光镊阱位（以及被它捕获的微粒）不动，周围环境（样品池）运动，也即对粒子而言是被动的操控；另一种是前者运动，后者不动，是主动的操控。第一种操控方式：在拖动过程中，光场分布不变，因而光镊的性能始终保持不变，这有利于对微小力进行测量。但这种方式不能改变多光镊间的相对
18、位置。第二种操控方式正好相反，拖动是靠激光束偏转扫描来实现的。该过程中，光场随之有相应的变化，导致光镊性能有微小变化。与前一种方式不同，这种操控方式在多光镊的情形，可以灵活改变该扫描光镊与其它光镊间的相对位置。在我们研制的装置中，二种操控方式都被采用,以适应不同应用研究的要求。例如，HeNe 光镊主要用作定量测量，因此在实验中该光束通常是固定不动的,以保证它在测量过程中始终保持有好的光镊性能，所以它的操控就采用被动方式。纳米光镊作为一种单个生物大分子的操控以及在分子水平上研究生命过程的技术手段，其操控定位精度当然要与分子的尺度相当。因此所选择的驱动方法必须保证操控能达到纳米精度。不同的驱动方法
19、能达到的精度是不同的，行程也各不相同。例如用压电转镜或声光偏转器偏转光束，即通过主动方式实现被捕获微粒与周围环境的相对运动。也可用纳米精度的压电扫描驱动器移动样品池，即通过被动方式实现被捕获微粒和周围环境的相对运动。这些方法的操控精度都可以达到或优于纳米，但行程较小。而步进马达有较大的行程，但通常操控精度只能达到微米量级。光镊阱位的控制精度和行程不但和设备本身的性能有关，通常还与驱动机构在光路中的位置以及相应的光学设计有关。在控制系统的设计中，驱动机构的选择，需要综合考虑精度的要求、行程的大小、在光路中的位置、以及价格因素。另外，还需要便于计算机控制。 我们采用了亚纳米精度的压电扫描平台（P-
20、517.3CL, PI, German） ，作为被动操控的驱动机构。它的移动范围是 。压电扫描平台m2010通过稳固的中间平台固定于显微镜机体上，作为样品平台。通过计算机控制该压电扫描平台带动样品池整体相对显微镜运动，也即控制液体环境（随样品池相对于显微镜运动）相对于三个光镊及它们所捕获的粒子（相对于显微镜静止）的运动。也就是说，这一操作能够实现样品相对周围环境的纳米精度的移动，但不改变光镊间的相对位置，光镊性能也不发生任何改变。实现多个光镊之间的相对运动，则需要采用主动方式，即使用光束扫描的方法，使某个光束形成的光镊可以相对别的光镊进行三维运动。我们称这样的光镊为扫描光镊（或动态光镊） 。通
21、常，光镊的纵向扫描和横向扫描是分别进行的。纵向扫描可以通过光路中，某个透镜的轴向（沿光束传播方向）移动来实现。而横向扫描是通过光束偏转来实现的。对于图 3.4 这样的基本光路，阱位平面（很靠近物镜焦平面）的共轭面为 C 平面（该平面位置很靠近显微镜设计中的 CCD 靶面位置） 。光镊的横向扫描也就是光束焦点在 C 平面上的扫描。由于显微光路把物平面的物放大 100 倍到 C 平面。即物平面和 C 平面之间有 100 倍的关系。如果我们需要光镊在物平面水平移动 10 微米，相应地，也就是要激光束在 C 平面的会聚点在该平面上移动 1 毫米。光镊的横向扫描主要有三种方式：移动透镜法，声光偏转法，旋
22、转反射镜法。图 3.4：光束横向扫描示意图移动透镜法是通过光路中某个透镜的三维移动 2 ，导致激光束会聚点的三维运动，即可自由操作光镊。如图 3.5，平行入射的激光束被透镜 L3 会聚到 C平面，如上所述 C 平面为阱位平面的共轭面。通过对透镜 L3 的三维调节，可以实现该光镊的三维自由运动。这种方法简单方便，通过对一个光学部件的调节即可以实现设计要求，缺点是移动透镜法会有较大的像差，精度较差，并且从后面的耦合光路设计中可以看出它将使物镜后瞳处的激光光斑发生偏离或者在该处的光斑直径发生变化，将导致进入物镜后瞳的激光光束发生变化，从而引起光镊捕获性能的变化。声光偏转法是利用声光效应偏转光束的 5
23、 。在光路中添加两个正交放置的声光调制器 AO1 和 AO2 组合成 AOD，通过调节其驱动电压可以实现对光束方向准确而快速的控制。这种方法操作精度高，可以实现非常精确的二维运动控制，重复性好，响应速度快。其缺点是由于形成光镊的是一级衍射光束，光路调节比较困难，并且激光功率的利用率过低。我们在最终建立的装置中采用了第三种方法旋转反射镜法。如图 3.4 所示，激光束被反射镜 M 反射后会聚在 C 平面上，然后由高数值孔径的显微物镜O 会聚在阱位平面，形成光镊。通过对反射镜 M 偏转角度的控制就可以实现光图 3.5：移动透镜法横向扫描示意图图 3.6：声光偏转法横向扫描示意图镊在水平面的二维移动。
24、反射镜 M 由计算机控制的压电偏转器驱动，操作精度高，可以实现高精度的光镊操作和定位，而且能量损失很低。综上所述，我们在纳米光镊系统中采用了压电偏转镜装置来实现光镊在横向上（水平面方向）的二维操作，通过步进马达装置控制光路中某个透镜沿着激光传播方向进行移动，实现了光镊的阱位在轴向（垂直于水平面方向）的运动（在光路耦合部分将进行详细讨论） 。这两种方法组合实现了光镊的三维操作。3.4.2 主动操控方式下的光镊光路设计光镊的主动操控方式总是伴随着光束在空间的变化。而在实际应用中，我们希望能够在采用主动方式灵活操作光镊的同时，保证光镊的性能稳定，以降低对实验操作的影响。为了保证主动操控过程中光镊具有
25、尽可能相同的捕获性能，就要求入射激光束在物镜后瞳处的状况尽可能保持相同或者变化不大。我们分别考虑在这样的要求下，光路设计上如何实现光镊横向和纵向操作。A 光镊在水平方向的移动光镊光路中，激光束在进入物镜后瞳前为准平行光束。若该准平行光束以不同角度入射进入物镜后瞳，物镜出射激光束焦点的位置也就不同，阱位就发生了改变。即通过控制偏转镜的偏转角度就可改变光镊在水平方向的位置。为了在光束偏转的过程中尽量保证激光束在物镜后瞳的充满状态，可以让物镜后瞳平面和偏转镜反射面形成共轭面，这样当激光束被偏转镜 M 偏转一个微小角度（激光束光轴始终经过偏转镜 M 的中心） ，在物镜后瞳处的激光束传播方向将发生偏转，但是激光束在物镜后瞳处的位置和尺寸基本不会发生变化，这样就保证了物镜后瞳处激光束的充满状态。图 3.7：光镊在水平方向的移动
