1、端粒和端粒酶的发现和其应用摘要：端粒对维持染色体的稳定和延长细胞寿命至关重要，其长度的维持有赖于端粒酶的存在。布莱克本和绍斯塔克发现端粒中的一种独特 DNA 序列能保护染色体免于退化，格雷德和布莱克本发现了端粒酶及其作用。这些发现揭示了端粒形成和端粒酶保护染色体的机理， 3 位美国科学家因此荣获 2009 年诺贝尔生理学或医学奖。端粒酶和端粒结构维持的研究为我们洞悉诸如癌症、衰老以及遗传疾病综合症等医学高度相关领域提供了新方略,并促进了目前正处于临床检测的基于以端粒酶活性及表达为目标的癌症治疗新策略的发展。综述了端粒和端粒酶发现的背景、过程及其作用。关键词：端粒 端粒酶 癌症 衰老 遗传疾病综
2、合症 2009 年诺贝尔生理学或医学由于揭示了染色体是如何通过端粒和端粒酶而得到保护的机理，2009 年诺贝尔生理学或医学奖授予伊丽莎白布莱克本( Elizabeth H Blackburn)，杰克绍斯塔克( Jack W Szostak)和卡萝尔格雷德(CarolW Greider) 3 位博士。他们解决了染色体末端是如何在持续的细胞分裂过程中避免遭受侵蚀或重组而得以幸存并维持自身结构稳定这一长期困惑生物学家的基本问题。通过创造性的基因试验,证实染色体末端具有经进化保留的结构与功能。随后，精细的生化研究揭示了负责染色体 DNA 末端合成的端粒酶这一早就预测到的对其内在 RNA 模板具有依赖性
3、的酶的存在。端粒酶的缺失将导致端粒重复结构在连续的细胞分裂中逐渐缩短，生命力受到抑制，并在复制衰老过程中以细胞死亡终结。人体中,编码端粒酶复合物的基因编码元件发生的突变将导致以癌变、干细胞再生和组织维持缺陷为特征的遗传疾病发生。许多能够无限增值的癌细胞能通过提高端粒酶活性来维持端粒结构稳定。端粒酶的发现深刻地影响着生物医药的研究并促进了目前处于评估阶段的癌症治疗的发展。1 端粒和端粒酶1.1 端粒端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构。人端粒是由 6 个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成。端粒有重要的生物学功能，可稳定染色体的功能，防止染色体 DNA 降解、末端融合，保护染色体结构基因 D
4、NA，调节正常细胞生长 1。正常细胞由于线性 DNA 复制 5末端消失，随体细胞不断增殖，端粒逐渐缩短，当细胞端粒缩至一定程度，细胞停止分裂，处于静止状态 2,3。故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(mistosis clock)，端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关 4。端粒结构的高度保守性表明端粒在维持染色体的完整性和保护染色体末端等具有非常重要的作用。同种生物不同组织的细胞，甚至相同组织的不同细胞由于处于不同的生命时相，端粒的长度也不一样。处于不同生命时期的端粒长度也不一样，胚胎细胞和生殖细胞的端粒长度要长于体细胞端粒的长度，并随着细胞分裂的不断进行，端粒长度将不断
5、缩短。端粒丢失到一定程度，就会失去染色体的保护作用，细胞即趋向衰老和死亡，所以端粒长度决定了细胞寿命，通过测定端粒长度可以预测细胞寿命。同时端粒还可能限制细胞的分裂次数，因此也有人将端粒的长度称为“生命时钟” 。1.2 端粒酶端粒酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒 DNA 加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力 5。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，端粒酶可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等
6、方面有重要作用。1.3 端粒酶与端粒端粒酶是使端粒延伸的反转录 DNA 合成酶。是 RNA 和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白复合物，其 RNA 组分为模板，蛋白组分具有催化活性，以端粒 3末端为引物，合成端粒重复序列。端粒酶的活性在真核细胞中可检测到，其功能是合成染色体末端的端粒，使每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度得以补偿，进而稳定端粒长度。主要特征是用它自身携带的RNA 作模板，通过逆转录合成 DNA。通过蛋白质-蛋白质相互作用在翻译后水平对端粒酶活性及功能进行调控，则是目前研究端粒酶调控机制的热点之一 4, 5。端粒酶-端粒和端粒酶合成端粒的功能是为了维持染色体的稳定性。没有端粒，则末端暴露，
7、易被外切酶水解。而有报道说端粒与生命长短有关，这只是个说法，还没成定论。端粒不是用 DNA 聚合酶来合成的，是用端粒酶来合成的。端粒酶-端粒假说和解决端粒酶问题的研究或许是解决人类长生不老的灵丹妙药，但衰老机制首先要明确的是人为什么会死亡，只有对这个过程机制的了解透彻并解决这一难题，人的永生将有可能实现。2 端粒 DNA 序列和端粒酶的发现历程2.1 端粒 DNA 序列的发现虽然端粒发现的很早，但在相当长的一段时间内，人们一直搞不清端粒的结构。1978 年，布莱克本在对四膜虫的研究中发现：四膜虫核糖体 DNA 分子末端结构中含有大量的重复片段，该末端富含大约 50 个串联重复的六核苷酸（CCC
8、CAA） 6。1980 年，当布莱克本在会议上报告她的这一发现的时候，引起了绍斯塔克的极大兴趣。他那时候试图在酿酒酵母中建构人工染色体，让它能够在细胞中像自然染色体一样复制。但是当环状质粒线性化转入酵母细胞后，它很快地被降解掉。它的降解是不是因为它的末端没有端粒序列保护呢？布莱克本的报告让绍斯塔克茅塞顿开，两人开始做一个跨越物种边界的实验. 布莱克本用四膜虫的 DNA 分离出 CCCCAA 序列，绍斯塔克将其整合到人工染色体上，并成功将其放回酵母细胞内，使人工染色体走入现实。由于端粒 DNA 来自四膜虫这种生物，却会保护完全不同的生物酵母的染色体，这就证明存在一种前所未知的基本机制。随后，这一
9、问题逐渐明朗，端粒 DNA 存在于从原生生物到高等动物人类的绝大多数生物体身上，如 1988 年发现了人类端粒重复序列为 TTAGGG。人工染色体的实现，使 DNA 的大片段克隆成为可能，后来为人类基因组测序立下了汗马功劳。 这也是基本上不属于端粒和端粒酶研究领域的绍斯塔克，能够与布莱克本和格雷德共同获得诺贝尔奖的重要原因。时间到了 1984 年，布莱克本实验室通过将酵母端粒克隆到线性人工染色体的方法，发现酵母的端粒序列是由不太规则的 TG1-3 /C1-3A 重复序列组成的 7。2.2 端粒酶的发现在 1984 年报道酵母端粒序列的同一篇文章中，布莱克本实验室发现了一个有趣的现象：带着四膜虫
10、端粒 DNA 的人工染色体导入到酵母后，被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端粒序列。由于端粒是由重复序列组成的，当时人们普遍猜想同源重组是延伸端粒补偿染色体末端隐缩的机制。但是同源重组只能复制出更多本身的序列，为什么在四膜虫端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜虫端粒本身的序列呢？这个现象同源重组是无力解释的。 布莱克本意识到，应该存在一种专门的“酶” ，专职端粒 DNA 的复制工作。这个黑匣子的打开一直等到格雷德到来。 20 世纪 80 年代早期，格雷德作为博士研究生加入布莱克本研究组后，开始用生物化学的方法寻找和鉴定他们假说中的端粒 DNA 聚合酶。她们推测，由于四膜虫成千上万的微小染色体都含
11、有端粒，四膜虫也该含有丰富的端粒 DNA 合成酶。在 1984 年的圣诞节，格雷德终于证实四膜虫细胞分离液中包含一种新的酶，它能够在体外以端粒序列为底物合成端粒六核苷酸重复序列。她们后来将这个酶命名为“端粒酶” 。端粒酶可以延长端粒 DNA，提供复制整条染色体的平台，使 DNA 复制不会错过最后部分染色体的整个长度。1985 年，两位女性格雷德和其导师布莱克本一道，把这项结果发表在细胞 （Cell）杂志上。紧接着她们对端粒酶活性进一步定性。布莱克本实验室做了个简单的实验，就是用RNA 酶处理样品，降解样品的 RNA，看看端粒酶活性是否受到影响。结果是酶活性竟然消失了。显然，端粒酶活性依赖于 R
12、NA。1989 年，格雷德等人通过跟踪端粒酶活性，纯化并克隆了四膜虫的端粒酶 RNA 亚基，发现 RNA 亚基有一段 RNA 序列正好和四膜虫的端粒 DNA 序列互补。端粒酶正是利用 RNA 亚基的这段序列作为模板，重复复制出端粒 DNA8。3 端粒和端粒酶的重要应用这些发现在包括癌症、衰老、干细胞维持及遗传病综合症的许多领域中具有重要的医学应用价值。3.1 癌症人们很快发现端粒在许多癌细胞系中是不正常的 9,10,端粒酶活性也提高了 80% - 90%11,12，无端粒酶活性的肿瘤细胞常显示有替代的端粒延伸(ALT)机制的作用 13,这与癌细胞具有无限复制能力相一致。 上述发现与所观察到的太
13、短或未被保护的端粒将诱发衰老并最终导致细胞死亡这一现在被认为对阻止细胞无限增殖及癌变起重要保护作用的机制统一起来。 缩短的和未被保护的端粒诱发基因组的失稳定及随后的细胞复制受阻和细胞死亡。有时基因的改变回避了上述反应而代之以细胞的转化及癌变。以上发现促生了各种基于端粒酶的治疗策略，而它们要么以阻遏端粒酶活性，要么采用癌症疫苗方法消灭端粒酶而抑制肿瘤细胞的过度增殖。当前与多种类型癌症相关的临床试验方兴未艾，而其中大多数是基于端粒酶的癌症免疫疗法( clinica ltri2als. gov)。不过,结论性的结论尚未取得。然而潜在的难题仍然不少，未被保护的端粒诱导的衰老及细胞程序性死亡的作用过程表
14、现为对 p53 依赖性，而许多肿瘤中为什么会存在未活化的 p53 突变体就是其中的难题之一。另一令人困惑的事实来自于小鼠模型中观测到的端粒酶的消失能诱发肿瘤，短端粒可能在某些情况下增强基因组的不稳定性并加速肿瘤发生。这与在有癌症倾向的以端粒酶功能缺陷为特征的家庭疾病综合症中观测到的现象相一致。格雷德的研究组最近报道了在小鼠中端粒的缩短诱发了非转录的原始细胞和肿瘤细胞中的端粒重组以及其它的端粒维持机制，这表明利用药物阻遏端粒酶的疗法可能存在问题。有报道称正常成体干细胞含有较长的端粒并具有端粒酶活性是当前另一值得关注的潜在事实。这也重申了抗端粒酶疗法具有引发副作用的风险。最近,基因组范围相关研究显
15、示 TRET 是诱发包括肺癌及 glioma 在内各种类型癌症的敏感基因，此外能降低端粒酶活性的 TERT 基因变异类型是导致急性 myeloid 白血病的风险因子 14。总之，有关抗端粒酶疗法背后的基本原理以及这种疗法是否能有效地抵制人类癌变的认知过程仍然任重道远。无论上文述及的有关肿瘤细胞中端粒维持的作用的研究有多复杂，该研究已被证实对我们理解癌变的生物学原理有意义重大。3.2 衰老早期的试验证实端粒的缩短与培养中的人类细胞复制力的减弱之间具有惊人的联系，这与在模式体系中获得的短端粒诱发衰老的早期遗传证据相一致。相反，将端粒酶引入培养中的正常人体细胞则能使其生命力得到延长，并明显没有引起其
16、它的细胞变化。然而其它的研究表明上皮细胞通过突变失活或促进甲基化来降低 p16 / INK4a 的表达的次生反应在获得永久表型的过程中扮演了重要角色。TERT 还具有与端粒维持无关，却能提高细胞增殖能力的潜能的事实使得有关过度表达 TERT 这一人体端粒酶蛋白的组成成分的研究结果变得复杂化。机体衰老和端粒酶活性及端粒长度二者之间的联系在端粒酶缺失及 TERT 这一端粒酶成分过度表达小鼠的研究中得到证实。然而有关端粒长度和细胞维持之间的关系还不能绝对化，端粒功能受损能导致不伴随有端粒逐渐缩短现象的组织退化 15，非常奇怪的是最新的研究显示 TERT 也可能促使组织起源细胞的具 TERT 逆转录酶
17、依赖性的增殖。相反, TERT 介导的涉及 Myc2 和 Wnt2 的转录程序的激活也证实非标准的反应机制的存在。此外，现在人们发现诱导的多功能干细胞( iPS)与胚胎干细胞的端粒性质在次生标记方面相似，并且通过端粒酶的重新导入端粒酶缺失小鼠细胞重组率降低的问题可以得到解决。不容置疑，端粒长度的维持及保护是控制细胞生命力的重要因素，但机体衰老是受多种因素影响的高度复杂过程。3.3 遗传疾病综合症编码 TERT 基因或属于人体端粒酶亚基的端粒酶 RNA 成分( TERC)亦或是编码一些端粒结合蛋白的基因发生干细胞系突变与获得性及先天性再生性障碍贫血症在基因水平存在联系。编码一种与核糖体 RNA
18、和 TERC 相互联系的蛋白质的 DKC1 基因发生突变将引发伴 X 染色体先天角质不全综合症(DKC)。其它形式的常染色体显性的先天角质不全归因于TERC、TERT 或者其它与端粒维持相关蛋白质的编码基因的突变,这为端粒酶缺陷是诱发该过程的潜在原因提供了可靠证据。在揭示缩短的端粒与以指甲萎缩，口腔黏膜白斑病以及异常的皮肤色素沉着等起决定性作用的特征外还以掉发、头发枯黄、牙齿脱落以及骨质疏松等早衰为标志特征的人类疾病之间存在联系的试验中 DKC 的端粒酶功能缺陷特征起了关键作用。其它的相关综合症被认为与 TERC 突变相关。在一些具原发性的家族流行肺纤维症病人中发现 TERT 和 TERC 以
19、及缩短端粒的杂合干细胞系发生了突变 16,17。正如所料，细胞广泛的功能保守性具重大意义，基因缺陷引发的端粒与端粒酶完整性受损是许多疾病的病因。有关潜在的分子机制的知识为正确诊断提供了可能性，并增强了人们对未来治疗学发展的信心。4 展望伊丽莎白布莱克本，卡萝尔格雷德和杰克绍斯塔克 3 位博士的发现解决了染色体是如何通过端粒和端粒酶而得到保护这一生物学基本问题，开辟了一全新的研究领域。端粒酶和端粒结构维持的研究为我们洞悉诸如癌症、衰老以及遗传疾病综合症等医学高度相关领域提供了新方略，尽管它们之间的联系比起初预测要更复杂。该发现也促进了目前正处于临床检测阶段的基于以端粒酶活性及表达为目标的癌症治疗
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