1、分子生物学在检验医学中的应用,一、分子生物学在检验医学中的常用技术,1、 PCR技术2、 RT-PCR技术3、 RFLP4、 SSCP5、 MSP6、 测序,二、外源性疾病的检验与诊断：,1、 细菌、支原体、衣原体、寄生虫、 病毒等2、 SARS冠状病毒的分子生物学检测,BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG
2、antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bpSAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp,二、内源性疾病的检验与诊断：,1、 临床基因变异酶的分子性质研究 1） 用PCR-SSCP技术发现我国第一例 LDH遗传变异病例,病 例 21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围：110-240 U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较
3、低水平，在 48-85 U/L之间,经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。,2n 2 3n 3 4n 4 5n 5 6n 6,2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及 对检验结果的影响,基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下
4、，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。,LDH-A基因变异类型_变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失A-220 AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化A-20 插入C 移码突变A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合A-213 丢失2 bp (CT) 移码突变A-251 丢失20 bp 移码突变,L
5、DH-B基因变异类型变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合B-103 8bp重复 移码突变B-131 AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合B-139 丢失2 bp (TC) 移码突变B-145 4bp重复 移码突变B-147 TAT-TAG Tyr-Ter 无义突变B-171 CGC-CCC Arg-Pro 基质结合B-172 TTT-GTT Phe-Val 基质结合B-173 CGC-CAC Arg-His P轴的安定性B-176 ATG-TTG Met-Leu 分子稳定性B-287 丢失1b
6、p(C) 移码突变B-320 GAT-GTT Asp-Val 电荷变化,3) CK变异的分子性质及对酶活力 的影响,病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科 心电图和临床症状提示AMI实验室检查： LDH 6900 U/L (200-400 U/L) LDH-1/LDH-2 1.72 CK 37 U/L (15-130 U/L) CK-MB 0 U/L,RT-PCR结果,外显子2 残基54处 A G GAC GGC 天冬氨酸 甘氨酸 位于酶结构的第4个-螺旋,4）变异酶人群的检验结果不同于常 规人群的检验结果,结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正
7、常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；,1） 2、 2、电泳异常带的分子性质研究,1） LDH异常电泳酶谱,M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 (+)LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 正常 H 缺失 M 缺失 H 变异 (slow) H 变异 (fast),H 发生变异时，产生H 和h M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 H1M3 h1M3 H2M2 H4 h2M2 h1 H3 hHM2 h2 H2 h3 H1 h4,2） 异常电泳酶谱的分子性质,1）核苷酸的变异
8、引起氨基酸的改变， 2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同， 3）变异的氨基酸位于分子的表面。 结果：产生异常的电泳结果,3） 异常谱形的分析方法,LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型 异常谱型 免疫对流、固定、混合法鉴定 遗传变异（H或M亚基变异） （+） （-） LDH-Ig复合物 肿瘤产生LDH 基因分析,LDH H/M 比值的计算,- LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5H亚基数 4 3 2 1 0M亚基数 0 1 2 3 4 % A B C D E-计算方法： H = A+ 3/4 B + 2/4 C + D M = 100 - H H/M = H / ( 100 H ),2、 后生性调控标志物,1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式,DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。,2） 启动子甲基化作为新的分子诊断 标志物的研究,3） 启动子甲基化在分析LDH异常带 分子性质中的首例应用,病例 4岁儿童 遗传性Rb 转移到颈淋巴结 血清LDH 升高 异常同工酶带LD2ex 位于 LD1和LD2之间,DNA,mRNA1,mRNA2,a,a,0,0,1 2 3 4 5 6 7,1 2 3 4 5 6 7,
