1、狂犬病快速诊断方法的建立和应用曹亮 11，扈荣良 *，张首纷（军事医学科学院军事兽医研究所 吉林 长春 130062）摘要：根据狂犬病病毒核蛋白基因序列设计了 1 对引物，利用 RT-PCR 技术从狂犬病病毒 CVS 株、8202 株和 SRV9 株的含毒细胞培养物及乳鼠脑组织中，扩增出 443bp 的核酸片段，敏感性约为 3pg。对36 份不同种动物脑组织的检测结果与传统方法荧光抗体试验（FAT ）和小鼠脑内接种试验（MIT ）的测定结果完全吻合，但前者可在 3h 内直接对组织匀浆进行诊断，具有快速、简便、和敏感的特点。关键词：狂犬病病毒；RT-PCR；检测中图分类号： 文献标识码： 文章编
2、号：1671-7236（2005）狂犬病是由狂犬病病毒感染中枢神经系统而引起的一种人畜共患传染病。狂犬病病毒（Rabies virus）为弹状病毒科（ Rhaboviridae）,狂犬病毒属（Lyssaavirus ）成员，其基因组为单股负链 RNA，编码 N、P、M、G 、L 等 5 种结构蛋白。核蛋白（N）基因高度保守又高效表达，可以用于狂犬病病毒感染的诊断和调查。本研究根据 N 基因的保守性设计了 1对引物，对狂犬病病毒不同毒株进行了 RT-PCR 检测，并对不同种动物脑组织进行了 RT-PCR 检测，旨在为及时诊断狂犬病提供一种可靠、快速、准确的监测手段。1. 材料与方法1.1 材料1
3、. 1.1 毒株和细胞株 CVS、8202 和 SRV9 毒株由本室保存，BHK-21 细胞由本室保存。1. 1. 2 试验样本 36 份脑组织（犬脑 12 份、鼠脑 10 份、牛脑 8 份、鹿脑 4 份、马脑 2份）均为 FAT 和 MIT 阳性，由各地收集本室保存。1. 1. 3 主要试剂 RNA 提取试剂、RT-PCR 试剂均购自 TaKaRa 公司1. 1. 4 主要仪器 PCR 仪（军事医学科学院放射研究所） 、电泳仪（北京六一仪器厂） 、高速台式冷冻离心机（Sigma） 、CO 2 培养箱（SANYO） 、凝 胶 自 动 成 像 系 统 （ UVI）1.2 病毒培养 以含 10%犊
4、牛血清的 MEM 营养液，按常规量加入双抗、谷氨酰胺和NaHCO3，待 BHK21 细胞长成单层后，以含 2%血清 MEM 营养液换液，同时按 2%分别接入 CVS 株、8202 株和 SRV9 株狂犬病病毒，置 33培养 7296h 收获病毒 1-3。分别将 20ul CVS 株、8202 株和 SRV9 株狂犬病病毒脑内接种 3 日龄乳鼠，待 4-5 天濒死期采取鼠脑。1.3 引物的设计与合成 根据 N 基因序列 4-6设计了 1 对引物 N1、N2，由上海生物工程公司合成。引物序列如下：N1：（587）5-TTT GAG ACT GCT CCT TTT G-3(605)N2：(1029)
5、 5-CC CAT ATA GCA TCC TAC-3(1013)1.4 RNA 的提取 病毒细胞培养物和鼠脑组织按 TRIZOL 一步法 7提取。1.5 RT-PCR 取 10 One Step RNA PCR Buffer 2.5 L、25 mM MgCl2 5 L、10 mM dNTP 2.5 L、Rnase Inhibitor、AMV 和 AMV-Optimized Taq 各 0.5 L、引物 1 L，制成混合液，加入 12.5 L DEPC 水溶解的 RNA，混合均匀后 50 30 min RT 反应，然后放入PCR 仪中，执行如下程序：94 变性 120s 后，于 94 30s、
6、50 90s、72 60s，循环扩增 30 次，最后 72延伸 10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.6 敏感性试验 将含毒的 BHK-21 细胞培养物中所提取 RNA 做 10 倍系列稀释后，进行 RT-PCR 扩增，比较其扩增的敏感性。1.7 重复性试验 将狂犬病病毒 CVS 株、8202 株和 SRV9 株的 RNA 反转录产物以 N1/N2分别作 3 次 PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，分析结果。1.8 应用性试验 取 36 份不同种动物脑组织，分别为：犬 12 份、鼠 10 份、牛 8 份、鹿4 份、马 2 份，均为 FAT 和 MIT 检测阳性。提取 RNA，使用引物 N1/N2
7、进行 RT-PCR 检测。2 结果2.1 RT-PCR 扩增 用设计的引物对狂犬病病毒 CVS 株、8202 株和 SRV9 株核酸进行 RT-PCR 扩增，结果均得到 443 bp 的核酸片段，与设计相符，说明其为特异性扩增产物。在相同的反应条件下，对照样品犬腺病毒和犬瘟热病毒及正常细胞培养物和鼠脑组织扩增结果为阴性。 （图 1 略）2.2 敏感性试验 以 N1/N2 引物对所提 RNA (3.25g)10-110-7 稀释后进行 RT-PCR，结果最小检出的 RNA 量为 3.25pg。 （图 2 略）2.3 重复性试验 经在不同时间 3 次对狂犬病病毒 CVS 株、8202 株和 SRV
8、9 株的 RNA 反转录产物进行 PCR 扩增，结果一致。2.4 应用性试验 对 36 份不同种动物脑组织进行 RT-PCR 检测，结果同样只产生 1 条 443 bp 的条带，阴性对照无特异条带，与 FAT 和 MIT 检测结果完全吻合。3 讨论本研究对 3 株狂犬病病毒进行了 RT-PCR 扩增，N1/N2 引物对所有毒株都能得到 1 条与预先设计大小相符的 443bp 条带，且对非狂犬病病毒及正常细胞培养物和鼠脑组织则未出现任何扩增条带。由此表明，所设计的引物对狂犬病病毒的扩增是特异的。试验中对狂犬病病毒的检测灵敏度可达 3pg。因此，RT-PCR 较常规方法更灵敏、特异，可直接用于临床
9、诊断。研究表明，狂犬病病毒各毒株间的核蛋白（N ）有高度保守性，不同株系的核蛋白同源性在 98%99.6%之间，为病毒中最稳定的蛋白 8。根据核蛋白（N）基因高度保守又高效表达，可以用于狂犬病病毒感染的诊断和调查。本研究以 N 基因序列设计的 N1/N2 对狂犬病病毒 CVS 株、8202 株和 SRV9 株培养物以及对 36 份不同种动物脑组织均能得到 443 bp 的扩增条带。RT-PCR 检出结果与传统试验鉴定结果完全一致。但经典方法在操作上费时、费力，花费昂贵，且不能立即得出确诊的结果。本试验证明了所设计的引物 N1/N2 能对大多数狂犬病毒株进行检测，方法敏感、特异，结果可靠，且节省
10、了时间，在 3h 内便可以出结果，不仅可以用于临床确诊，还可用于流行病学分析。RT-PCR 对内外环境要求严格，外部环境要求尽量净化空气、一次性用品，内部环境要求 PCR 仪器内反应温度要均一。扩增成功还要求检测时取样准确，一般是取材部位所含病毒量越多越容易准确诊断，本研究针对细胞培养物和脑组织进行了试验，而其他组织中是否能快速、准确的检测到病毒还有待进一步研究。参 考 文 献1Echevarra J E,et al. J Clin Microbiol. 2001 Oct; 39(10): 3678-3683.2Schwab K J,et al. Appl Environ Microbiol.
11、 2001 Feb; 67(2): 742-749.3 Mikako ITO ,et al. Vet.Med.Sci. 63(12) :1309-1313, 2001.4Debora Sacramento,et al. Molecular and Cellular Probes (1991) 5, 229-240.5 Picard-Meyer E,et al. Vaccine. 2004 May 7;22(15-16):1921-9.6 David D,et al. Vet Microbiol. 2002 Jun 20;87(2):111-8.7 J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，黄培堂 等
12、 译M. 分子克隆实验指南（第三版）M.2002，科学出版社.8 殷震，刘景华主编. 动物病毒学（第二版）M. 1997，科学出版社.The Development and Application of Rapid Diagnosis for Rabies VirusAbstract : We have developed the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification technique of viral nucleic acids as an alternative protoco
13、l for diagnosis of rabies and rabies related strains.A primer set mapping in the nucleoptotein cistron allowed a specific and sensitive amplification of infected mouse brain material and tissue-culture supernatant.36 brain samples from different animal species:12 dogs,10 mice,8 cattle,4 deer,2 horse,which were found to be positive by means of the fluorescent antibody test (FAT) and the mouse inoculation test (MIT) were retested with RT-PCR.Compared with FAT and MIT ,RT-PCR was more rapid and efficient to detect rabies virus.Key words : rabies virus , RT-PCR , detection
