1、第三章 荧光分光光度法,(Fluorescence Spectrophotometry),前言：1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。1868年 Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。,时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。,在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高23个数量级
2、）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。,在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。,随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。例如：X-荧光、红外荧光等。,除了吸收光能使分子激发而发光，根据起
3、始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。,化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。,荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。 本章主要讨论荧光分析。,3.1 分子荧光产生的本质（Molecular Fluorescence） 图3-1 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图,1.产生荧光的原因 荧光物质
4、的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发态或第二电子激发态，然后通过无辐射跃迁返回到第一电子激发态的最低振动能级上，再从该能级降落至基态的各个不同的振动能级上，同时放出相应能量的分子荧光，最后以无辐射形式回到基态的最低振动能级。,需要注意的是：（1）整个过程是在单线态之间进行的；（2）产生荧光的过程极快，约在10-8秒左右内完成；（3）荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始，而与荧光分子被激发至哪一个能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长无关。,2. 磷光(Phosphorescence) 当某些物质分子被激发到较高的能级，并通过无辐射跃迁降落至第一电子激
5、发态的最低振动能级之后，尚不能继续直接降落至基态，而是通过另一次无辐射跃迁降至一个中间的亚稳态能级三重线态上，这些分子在三重线态上经短暂停留后，再降落至基态的各个不同的振动能级上，同时发出辐射光，称这种发出的辐射光为磷光。,磷光与荧光的区别主要为：（1）产生磷光的过程稍长，约在10-5 秒0.1 秒，有时长达1秒以上；（2）在辐射停止几秒或更长一段时间后，仍能检测到磷光，而上述荧光现象在照射光一旦停止照射，荧光便立即消失。,3. 迟滞荧光（延迟荧光） 某些分子在跃迁至三重线态之后，通过热激活作用，可以再回升至第一电子激发态的各振动能级上，然后再由第一电子激发态的最低振动能级（v=0）降落至基态
6、的各个不同振动能级而发出荧光，这种光叫做迟滞荧光（或：延迟荧光）。,. 分子吸收光谱与分子荧光光谱的关系 分子吸收光谱和分子荧光光谱都是分子内部振动能级结构的反映，但是分子吸收光谱是反映电子激发态中各个振动能级结构情况。 在大多数分子中，由于电子激发态和电子基态的各个振动能级结构相似，因此吸收光谱和荧光光谱往往呈现大致的镜像对称关系。,3.2 荧光与物质分子结构之间的关系. 物质产生荧光的两个必须条件物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度的大小有着紧密有关。 分子产生荧光必须具备两个条件：（1）物质分子必须具有能吸收一定频率光的特征结构；,（2）物质分子在吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有高的
7、荧光率，即具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency）。荧光效率（又称量子产率，记为）=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数,荧光效率愈大，荧光的发射强度愈大，无辐射跃迁几率就愈小。 当荧光效率等于零时就意味着不能发射荧光。因此，荧光物质必须具有较大的荧光效率。,. 物质产生荧光与其分子结构的关系(1) 有机化合物的结构与分子荧光的关系 什么样结构的有机化合物会发出荧光？一般可以从以下三方面来分析：,a. 碳原子骨架 一般含有共扼体系的分子可产生荧光。共扼度越大，则离域电子愈易被激发，愈易产生荧光。所以绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。,b. 分子的几何排布 物质的分子
8、为平面型，且具有一定的刚性结构，这样的分子荧光强烈。,对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没有荧光。,c. 芳环上取代基的类型和位置 (!) 类型 有些取代基可增强荧光。 例如：-OH、-NHR、-NR2等； 有些取代基可减弱荧光。 例如：-COOH、-C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。 例如：-F、-SH、-SO3H等。,(!）位置 邻、对位取代，荧光增强；间位取代，荧光减弱。,注：分子所处的环境，例如：溶剂、温度、pH等都可能会影响分子的结构或立体构象，当然也就会影响分子能否产生荧光。,(2) 无机化合物的荧光 除过渡元素的
9、顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧光。 但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定。,不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发出荧光。,例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。这也是由于刚性和其平面性增加所致。 一般来说，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。,螯合物中金属离子的发光机理，通常是螯合物首先通过配位体
10、的*跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是d*d跃迁或f*f跃迁光谱。,3.3 荧光分析的方法及影响因素1. 荧光参数(1) 激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光法进行物质的定性、定量分析的基本参数和依据。,a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化的关系曲线，叫激发光谱。,b. 发射光谱：选择并固定激发波长EX和狭缝宽度S，让发射单色器进行波长扫描，记录荧光强度（F）随发射波长的变化而变化的关系曲线，叫发射光谱。,注意：上述记录的激发和发射光谱均为“
11、表观光谱”，它受仪器的光源特性、单色器的特性和检测器的特性等因素影响。,对于同一试样，用不同的荧光仪记录的“表观光谱”需进行校正，经过校正的光谱称为“真实荧光光谱”又叫“校正光谱”。 现代化的仪器都具有自动记录校正光谱的功能。,(2)荧光强度荧光物质吸收辐射能后才发射荧光，因此溶液的荧光强度和该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。 设I0和I分别为照射在待测溶液上的入射光和透过光强度，c和l分别为待测溶液浓度和液层厚度，则被测溶液吸收的光强度为：I a = I 0-I,根据光的吸收定律，得：I=I010-cl 则： I a =I0-I=I0-I010-cl= I0(1- e-2.3
12、03cl) (3-1),因为溶液的荧光发射强度F和它吸收的光能I a成正比，并且与荧光物质的荧光效率有关。所以： F= I a= I0(1-e-2.303cl) (3-2)式中： 为荧光效率，而其中e-2.303cl展开得 e-2.303cl=1-2.303cl+(-2.303cl)2/2!+ (-2.303cl)3/3!+ (3-3),若溶液浓度c很低， 、l都是定值，则cl的值很小，当A=cl0.05时，上面级数展开式中第二项以后的各项可以忽略不计，因此：,e-CL = 1- 2.303cl (3-4) 将（3-4）代入（3-2）得 ： F= 2.303 I0cl (3-5) 当入射光强度
13、I0一定时， F= Kc (3-6) 注意：上式在一定浓度范围内适用。,荧光物质的最大浓度为Cmax 0.05/L左右。当浓度较大时，即它的吸光度大于0.05时，荧光强度与其浓度的线性关系将发生偏离。荧光测定的线性范围一般在10-5100 g mL-1之间。 在浓度较高时，产生这种偏离的原因可能是激发分子间互相碰撞而失去能量(自身猝灭)，或者是荧光被未激发的分子所吸收(自身吸收)。,(3) 荧光总量 荧光发射谱的面积积分，称为荧光总量。(4) 峰值波长和谱带宽度 a. 峰值波长在谱图（包括激发谱和发射谱）中具有最大荧光强度所对应的波长，称为峰值波长。,b. 谱带宽度常用“半宽”来表示，即荧光峰
14、强度值的一半时所对应的波长宽度。 或：荧光谱的半高宽称为谱带宽度。,(5) 量子产率（或称：荧光效率） =发出的光量子数/吸收的光量子数。,(6) 荧光偏振 在研究分子的结构变化时用。用来研究荧光的各向异性（荧光的偏振性）。它是在激发和发射光路中引入两个偏正器。它可用偏振度（P）表示：P=（FII -F）/（FII +F） 式中：FII表示与激发光振动方向平行振动的偏光成分；F表示与激发光振动方向垂直振动的偏光成分。,(7) 荧光寿命 它是研究分子结构时要求的参数。 定义：荧光强度衰减到1/e所需的时间，用表示。 任意时间（t）的荧光强度： If =If0e-t/=If0e-kt 式中：If移
15、去激发光源后任一时间t时的荧光强度；If0激发时最大的荧光强度；K仪器衰减常数；激发态的平均寿命。,(8) 荧光分析的灵敏度 对整个发射光谱而言； /H 对部分发射光谱而言，即对所测到的不是整个荧光光谱，只是靠近荧光峰的一个狭窄的谱带（H为荧光峰的半高宽/谱带宽度）。,2. 荧光分析方法（1）定性方法 不同分子结构的各种荧光物质，具有不同的激发光谱（即：吸收光谱）和荧光光谱，这是分子荧光分析的定性依据。,在定性分析时，一般是在一定实验条件下，用荧光分光光度计作试样和标样的激发光谱和荧光光谱，然后比较它们的光谱图，即可鉴定试样物质。有时需改变溶剂后再比较它们的光谱图，如二者一致，即为同一物质。,
16、（2）定量方法 目前，荧光分析多数用于荧光物质的定量分析。常用的定量方法有直接比较法、工作曲线法和内标法。,a. 直接比较法 设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度，FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样荧光值和试样、标样的本底荧光值。 因为：FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或 Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。,b. 工作曲线法 先配一系列不同浓度的标准溶液并分别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光
17、值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线的线性情况，可确定试液的最高浓度范围。,c. 内标法 设C x、Cs分别为试样和标样浓度，F x、Fx0分别为试样和试样本底的荧光值；F s +x为试样加标样的混合溶液的荧光值。 则 Cx/CS=( FX - FX0)/( FS +x Fx) 或 Cx =CS( FX - FX0)/( FS +x Fx),除了这种内标计算法外，也可采用类似工作曲线的内标曲线法来求批量试样的浓度。 用内标法时，由于试样和标样的荧光值是在相同体系中测定的，因此可消除试样中某些杂质荧光的干扰
18、。,3. 荧光分析中的主要影响因素（1）溶液浓度 要求c0.05/L，当高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原因，使荧光强度与分子浓度不呈线性关系。,（2）溶剂的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光峰的波长越大，荧光效率也越大。,在含有重原子的溶剂（例如：碘乙烷CH3CH2I 和四溴化碳CBr4）中，也是由于重原子效应，增加系间窜跃速度，会使荧光减弱、磷光则相应增强。 溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂的拉曼光谱可能干扰测定。 若拉曼光处于荧光波长中，则产生干扰。,消除干扰的方法有：（a）选用高分辨的仪器。（b）对纯溶剂的拉曼峰进行测定，然后在荧光光谱中进行校正。,（3）温度的影响 大多数荧光物质都
19、随其所在溶液的温度升高荧光效率下降，荧光强度减小。 例如：荧光素钠的乙醇溶液在-80 C时，其荧光效率可达100 %，当温度每增加10 C时，荧光效率约减小3 %。,显然随着溶液温度升高，会增加分子间碰撞的次数，促进分子内能的转化，从而导致荧光强度下降。为此在许多荧光计的液槽上配有低温装置，以提高灵敏度。,（4）pH的影响 当荧光物质为弱酸或弱碱时，溶液pH的改变对溶液的荧光强度有很大的影响，这是因为它们的分子和它们的离子在电子构型上的差异。,例如：苯酚离子化后，其荧光消失；但对两个苯环相联的化合物，又表现出相反的性能，分子形式无荧光，离子化后显荧光。例如：-萘酚。因此，对具有荧光性质的弱酸、
20、弱碱而言，可将其分子和离子视为不同的品种，它们各有自己特殊的荧光效率和荧光光谱。,（5）荧光的熄灭荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光熄灭。这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。引起溶液中荧光熄灭的原因很多，机理也很复杂。下面讨论几种导致荧光熄灭作用的主要类型。,（a）碰撞熄灭 碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。 它是指处于单重激发态的荧光分子M*与熄灭剂Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。,碰撞熄灭的定量方程： F0/F-1=k Q 上式称为：Stern-Volmer方程式。 式中：k为熄灭常数；Q为熄灭剂浓度，单位molL-
21、1；F0、F分别为熄灭剂不存在时和存在时，溶液的荧光强度。,）k与体系的粘度有关系，粘度越大，k越小；）k与体系的温度有关系，温度升高，k也升高；温度每升高1 C，k值增加在2 %以下；）熄灭剂的浓度Q不得大于10 molL-1。,（b）组成化合物的熄灭有些荧光熄灭现象不能用碰撞熄灭理论来解释。 例如：某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后， （*）溶液的吸收光谱有了显著的改变； （*）溶液的荧光强度显著降低。,比如：吖啶黄溶液受核酸的熄灭便是一个例子。加少量的核酸将使吖啶黄溶液的荧光熄灭，且溶液的吸收光谱也发生显著位移。 又如：某些荧光物质的溶液在加入熄灭剂之后，它的荧光强度随着温度的升高而增
22、强。 以上几种情况都是因为组成化合物熄灭所致。,上述情况可能是： 络合 M（有荧光）+ Q MQ（无荧光） 分解T， MQ M+ Q （荧光增强）如果MQ的形成是由于强大的力，则MQ将具有它自己的特征吸收，因此溶液的吸收光谱也发生了改变。,（c）转入三重线态（级）的熄灭含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下不发光，它们将多余的能量消耗于它们与其它分子的碰撞之中，因而引起荧光熄灭。,溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用，促进形
23、成顺磁性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。 实验证明：O2的熄灭作用，似乎是随溶剂的介电常数的减小而增加，所以O2在水溶液中熄灭作用较小，而在有机溶剂中熄灭作用较强。,（d）发生电子转移反应的熄灭 某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互作用时，发生了电子转移的反应，即氧化-还原反应，因而引起荧光的熄灭。 例如：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭 D* + Fe2+ D- + Fe3+ 有荧光 无荧光,发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子，I-， Br-，S2O32-等易于给出电子的阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。,（e）荧光物质的自熄灭荧光物质溶液的浓度大于1gL-
24、1时，常常发生自熄灭现象，所以液态纯物质的荧光一般都不强烈。 此种熄灭的原因：）由于浓度大，分子碰撞几率大，因而引起能量损失大；）溶液浓度过高，物质分子发生二聚体乃至多聚体，这些多聚体不发光。,综上所述： 无论何种类型的熄灭作用，均随熄灭剂浓度的增加而增大。 如对试液进行稀释则可消除或降低荧光的熄灭作用。 这里O2的熄灭作用并未消除，需在试液中通N2或CO2以驱逐O2，方可达到消除的目的。,（6）光散射光散射常常关系到一个实验的灵敏度和再现性。 实践中常遇到的光散射包括溶液的瑞利散射和拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射（丁铎尔散射）。,当物质分子吸收了频率较低的光能后，并不足使分子中的电子跃迁到
25、电子的激发态，而只是上升到基态中较高的振动能级上去，若在10-15 s10-12 s返回到原能级，此时辐射出和激发光相同波长的光，称为瑞利散射。,若返回到较原能级稍高或稍低的振动能级上，辐射出较激发光稍长或稍短的光，称为拉曼散射。,（7）表面吸附在稀溶液中（1 gmL-1），表面吸附尤为明显，特别是有机溶剂，此吸附更为厉害。溶质常常吸附在瓶子、吸管和吸收池等壁上。 芳香族化合物易吸附，并且所用溶剂的极性越小，吸附就越大。 在非极性溶剂中加一点极性溶剂，常常可以减少这种吸附损失。,3.4 荧光分析的仪器、特点及注意事项. 荧光的分析仪器,图3-6 荧光分析仪基本部件示意图,光源发出的光，经第一单
26、色器（激发单色器）后，得到所需要的激发光波长。 荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光，但为了消除入射光及散射光的影响，荧光的测定应在与激发光呈直角的方向上进行。,仪器中的第二单色器称为荧光单色器。它的作用是消除溶液中可能共存的其它光线的干扰，以获得所需要的荧光。,（1）光源 光源应具有强度大、适用波长范围宽两个特点。常用光源有高压汞灯和氙弧灯。 高压汞灯常用在荧光计中，发射强度大而稳定，但不是连续光谱。高压汞灯的平均寿命均为1500 h3000 h，荧光分析中常用的是365 nm、405 nm和436 nm三条谱线。,氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强度大，可用于200 nm700 nm波
27、长范围。在200 nm 400 nm波段内，光谱强度几乎相等。但氙灯需要稳压电源以保证光源的稳定。,此外，高功率连续可调染料激光光源是一种新型的荧光激发光源。 激光光源的单色性好、强度大。脉冲激光的光照射时间短，并可避免感光物质的分解。,（2）滤光片和单色器 在荧光计中，通常采用激发滤光片和荧光滤光片作为激发光束和荧光辐射的波长选择器。,而大部分的荧光光度计中至少选用一个，而常常是用两个光栅单色器，且均带有可调狭缝，以供选择合适的通带。,激发滤光片、激发单色器的作用是让所选择的激发光透过并照射于被测试样上。 荧光滤光片、发射单色器的作用是把激发光所发生的容器表面的散射光、瑞利散射光和拉曼光以及
28、溶液中的杂质荧光滤去，让荧光物质发出的荧光通过而照射到检测器上。,分光荧光计的入射狭缝及出射狭缝是用以控制通过波长的谱带宽度及照射到测定试样上的光能强度的。 测定的目的不同，可以选择不同的狭缝，以获得较好的测定结果。,（3）试样池 荧光分析用的试样池需用低荧光材料制成。常用石英为材料。 试样池的形状以散射光较小的方形为宜。有的荧光计附有恒温装置，便于控制温度。 测定低温荧光时，在石英池外套上一个盛有液氮的石英真空瓶，以便降低温度。,（4）检测器 荧光的强度比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。 在荧光计中常用光电池或光电管检测。但在荧光分光光度计中常用光电倍增管检测。,二极管阵列和电荷转移检测
29、器也应用于荧光光度计，它们可以迅速地记录激发和发射光谱，特别适用于与色谱法或电泳法的联用技术。此外，可以记录二维荧光光谱图。,目前，设计的许多荧光光度计具有不少新的功能。 采用双光束荧光分析装置，可以提高方法的精度； 采用凹面全息光栅的大孔径异面光学系统，可减少杂散光的影响，并使检测限达5 pgmL-1；,采用“区分器”装置，可以识别暗电流而不予记录，以减少荧光信号的噪音等。 不少仪器中还配有累加、微分、偏振、流动注射和液相色谱联用装置等，大大扩展了荧光分析的应用范围。,光学纤维可在远离光源和检测器不同的区域中，进行几种荧光物质的分析。 它是通过光学纤维将激发光源发出的辐射传输到待测试样，然后
30、由同样的光学纤维将发射的荧光传输返回到检测器，进行测定。,2. 荧光分析的特点及注意事项（1）荧光分析的特点a. 灵敏度高 分子荧光法的灵敏度通常比分子吸收光谱法高几个数量级（测定下限为：0.1 gg-1 0.001 gg-1）。,这是因为在荧光分析中，可以采用高强度的光源和高灵敏度的荧光检测系统，从而大大地提高了它的分析灵敏度。 F= 2.303 I0cl 而在分子吸收光谱法中，由于是测量入 射光和透射光的比率，因而采取提高光源强度的办法不能提高分析灵敏度。A=lgI0/I= cl,b. 干扰少 由于多种分子在紫外-可见光区都能产生吸收，但是其中只有一部分分子能再发射荧光，因此分子荧光法的固
31、有干扰少。,c. 选择性强 因为荧光法不但可依据其特征发射（发射光谱），而且可以依据其特征吸收（激发光谱）来鉴定物质。 而分光光度法只能根据被测物的特征吸收谱来鉴定。,d. 试样量少且方法简便 使用荧光微池，用10 L试液即可。e. 能同时提供较多的物理参数 包括：激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光总量、极值峰位、谱带宽度、量子产率、荧光寿命和荧光偏振等参数。,（2）注意事项 荧光分析虽有各种优点，但也有其弱点，由于它对环境因素特别敏感，所以在荧光测定时，干扰因素也比较多，很容易受污染。,a. 溶剂和化学试剂 对于溶剂，一是选择要适当，二是要足够纯。在使用波段范围内，选用的溶剂应无吸收才好；另
32、外溶剂中也不应含有卤素、硝基化合物等，否则会降低荧光强度。 对于试剂，越纯越好。,b. 荧光的污染 荧光的污染源很多（例如：活塞的润滑油、橡皮塞和软木塞、去污粉、洗液、滤纸和微生物等）。 试验器皿须用1:1 (v/v)硝酸浸泡24小时或煮沸，再用蒸馏水洗净，凉干备用。,3.5 荧光分析的实验技术1. 荧光计的校正（1）灵敏度的校正 荧光计的灵敏度可用被测出的最低信号来表示；或用某一标准荧光物质的稀溶液在一定激发波长照射下，能发射出最低信噪比时荧光物质的最低浓度表示。,荧光分光光度计的灵敏度与三方面有关：(a) 与仪器光源强度、单色器（包括：透镜、反射镜等）的性能、放大系统的特征和光电倍增管的灵
33、敏度有关；(b) 与所选用的波长及狭缝宽度有关；(c) 与空白溶剂的拉曼散射光、激发光和杂质荧光有关。,由于影响荧光计灵敏度的因素很多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器，在不同时间操作所测得的结果也不尽相同。,因此在每次测定时，在选定波长及狭缝宽度的条件下，先用一种稳定的荧光物质，配成浓度一致的标准溶液进行校正（或称：标定），使每次所测得的荧光强度调节到相同的数值（50 %或100 %）。 如果被测物质所产生的荧光很稳定，自身就可作为标准溶液。,从紫外区到可见区常用的标准荧光物质有：酚（溶于甲醇）、吲哚（溶于乙醇）、奎宁（溶于0.05 molL-1的H2SO4溶液）及荧光素（溶于水或乙醇）等。,
34、最常用的是硫酸奎宁，产生的荧光十分稳定。 用0.001 g的奎宁标准品溶于0.05 molL-1的硫酸中，使其浓度为1 gmL-1，将此溶液进行稀释后用于仪器校正。,（2）波长校正 荧光分光光度计的波长刻度在出厂前一般都经过校正，但若仪器的光学系统和检测器有所变动，或在较长时间使用后，或在重要部件更换之后，有必要用汞弧灯的标准谱线对单色器的波长刻度重新校正，特别在精细分析工作中尤为重要。,（3）激发光谱和荧光光谱校正 用荧光分光光度计测得的激发光谱或荧光光谱，往往是表观的，不是真实的。 其原因很多：单色器波长刻度不够准确；拉曼散射光的影响以及狭缝宽度较大等，但这些因素都可消除或得到校正。最主要
35、的是光源的强度随波长而变，检测器的响应与波长不成线性。,当用单光束荧光分光光度计测定激发光谱和荧光光谱时，因为不用参比溶液作相对校正，影响特别大。尤其是当峰的波长处在检测器灵敏度曲线的陡坡时，误差最显著。,因此，先将每一波长的光源强度调整到一致（用仪器附有的校正设备），然后根据表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的响应强度进行校正，以消除这种误差。校正的方法常由于仪器不同而不完全相同。 目前生产的荧光分光光度计大多采用双光束光路，可用参比光束抵消光学误差。,2. 实验新技术（1）时间分辨技术 时间分辨发光光谱技术是基于不同发光体的发光衰减速率的不同，配置使用带时间延迟设备的脉冲光源（闪
36、光灯或激光器）和带有门控时间电路的检测器件，通过选定延迟时间td和门控时间t g，对发射单色器进行扫描，得到时间分辨发射光谱，从而实现对光谱重叠但发光寿命不同的组分进行分辨和分别测定。,或者固定激发与发射波长，对门控时间扫描，得到发光强度随时间的衰减曲线，从而实现发光寿命的测量。 时间分辨技术还能利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定。,（2）偏振和各向异性技术 在偏振光激发下，荧光体所发射的荧光在空间取向强度不同，即偏振光。 荧光偏振和各向异性可按照下图测定，即只需在荧光分光光度计的激发和发射光路上分别加上起偏器和检偏器（统称：偏振附件）。,在处的荧光偏振P()和各向异性r()值可按如下
37、公式计算：P() = III()- GI()/ III()+ GI()r() = III()- GI()/ III()+ 2GI() 式中：III()和I()分别是检测器的取向平行和垂直于起偏器取向时在波长处观察到的荧光强度，G为校正因子，可实验测定。,由于荧光偏振不仅与荧光体分子形状、光选择性和荧光体吸光对偏振激发的取向等内在因素有关，而且许多外界因素，例如：环境的粘度等都会影响和改变其偏振度，从而在生化领域中获得了广泛的应用。,例如：已用于生物分子间的缔合反应，膜内微粘度和膜组成对膜相变的影响，蛋白质的衰变和转动速度等研究中。,利用荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比这一特性，可用于荧光
38、免疫分析。 例如：当小分子荧光体被联结到大分子蛋白质或抗体之后，由于体积变大，分子转动速度变慢，偏振度增大。 若样品中存在小分子抗原，则联结于抗体上的荧光体可能被抗原夺走，结果偏振度又下降，因而可用于抗体或抗原测定。,若采用脉冲偏振光激发荧光体，还可以进行荧光偏振及各向异性的时间分辨测量。,（3）同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描技术可分为：固定波长差、固定能量差和可变角（可变波长）同步扫描。,同步扫描技术具有使光谱简化，谱带窄化，提高分辨率，减少光谱重叠，提高选择性和减少散射光影响等诸多优点。,固定波长差同步扫描中，波长差的选择直接影响到同步光谱的形状
39、、带宽和信号强度，从而提供了一种提高选择性的途径。,目前，有关合适的选择已有若干理论研究，但在实际应用中多根据具体的发光体系通过实验加以选择。 在可能的条件下，选择等于Stokes位移的值是有利的，有可能获得荧光信号最强，半峰宽最小的同步荧光光谱。,Stokes位移 由于荧光物质分子吸收的光能经过无辐射去激的消耗后，降至S1态的最低振荡能级，因而所发射光的波长比激发光波长要长，能量要比激发光小，激发峰位和发射峰位的波长之间的差值是表示一个分子发光特性的物理常数，这个常数被称为Stokes位移。,固定能量差（）同步扫描可能克服0-0带跃迁非常弱甚至不显现的情况，以及不同组分对的不同要求所带来的困
40、难。有可能对同一类化合物（例如：多环芳烃）只选择一个值用于整个光谱的扫描。同时还能最大限度地减小瑞利散射和拉曼散射的干扰。,可变角同步扫描技术可进一步提高测量的选择性。,同步荧光分析方法的应用： 固定波长差同步荧光分析 多环芳烃和生物大分子的检测 小分子与蛋白相互作用的热力学研究 固定能量差同步荧光分析 多环芳烃的检测,可变角同步荧光分析天然产物检测高背景体系中微量组分的检测,（4）三维光谱 三维荧光光谱（亦称：总发光光谱或激发-发射矩阵图）技术与常规荧光分析的主要区别是能获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息。,三维荧光光谱有两种表示形式：等（强度）高线图和等角三维投影图。 等高线图
41、易于获得更多的信息和体现与常规荧光光谱和同步光谱的关系。,三维光谱技术能获得完整的光谱信息，是一种很有价值的光谱指纹技术。 可在石油勘采中用于油气显示和矿源判定； 在环境检测和法庭判证中用于类似可疑物的鉴别；,临床医学中用于癌细胞的辅助诊断和不同细菌的表征和鉴别； 另外，作为一种快速检测技术，对化学反应的多组分动力学研究具有独特的优点。,3.6 荧光分析的用途 分子荧光分析，是测量试样溶液在光源辐射激发下产生的荧光光谱及荧光强度，从而鉴别待测物质和测定其含量的一种分子光谱分析方法。 它实际上是一种利用光能激发的分子发射光谱分析。 它在实际应用中主要用于微量物质的定量分析。,荧光法作为一种高灵敏
42、度的分析手段，被广泛地应用于各个领域。 可用荧光法测定的元素达70多种，可用荧光法测定的有机化合物为数更多，至少在数百种以上。,1. 无机化合物的荧光分析 能发生分子荧光的无机物很少，因此一些无机元素需与某些有机试剂生成荧光络合物后进行间接测定。 较常采用荧光法测定的元素有Be、Al、B、Ga 、Se、Mg及某些稀土元素。 可测量约60多种元素，测定的方法可以分为以下四种：,（1）荧光熄灭法 一些元素可用荧光熄灭法进行测定，这些元素的离子从发生荧光的其它金属有机试剂络合物中夺取该有机试剂或金属离子以组成更稳定的络合物或难溶化合物，从而导致荧光强度的降低，由荧光强度降低的程度来测定该元素的含量。 用该法测定的元素有：F、Cl、S、Fe、Ag、Co和Ni等。,（2）催化荧光法 某些荧光反应进行非常缓慢，荧光微弱，难于测定，但若有微量金属离子存在，可起催化作用，反应将大大加速，可由在给定时间内所测定的荧光强度来定量该起催化作用的金属离子，称为催化荧光法。 用该法测定的元素有Cu、Be、Fe、Co、Os及H2O2等，该方法灵敏度特高，有的可达0.1 ngg-1。,（3）低温荧光法 测定的元素有Cr、Nb 、U和Te等（-196 C液氮温度下）。,（4）固体荧光法 测定的元素有U、Ce、Sm、Eu、Tb等稀土元素及Sb和V等。,
