1、 1 中华圆田螺抗菌肽 理化性质 及 抑癌 活性测定 杨丽丽 1, 王斌 1 ,朱化化 2 ,李玉萍 1 ,刘建涛 1,* （ 1.江西科技师范大学 生命科学学院 ， 江西 南昌 330000； 2.瑞莱生物工程有限公司 ， 广东 深圳 518000） 摘 要 ： 筛选 中华圆田螺 抗菌活性物质，检测其抗肿瘤活性。 本实验 通过注射大肠杆菌免疫中华圆田螺，收集血淋巴并通过高温处理制成含有抗菌肽的粗提液，测定其抗菌效果 和 理化特性。 以人 体 肺 腺 癌细胞 A549为体外实验模型，通过细 MTT 实验，研究 中华圆田螺 抗菌肽对 人 体 肺 腺 癌细胞 A549 细胞 的生长抑制作用。 经过
2、分离得到 含有中华圆田螺抗菌肽的粗提液 。 粗提液抑菌效果明显；其抑菌活性随着处理温度的升高，处理时间的延长呈现逐步降低的趋势，但仍表现出较好热稳定性；在弱酸性（ pH46）条件下，随着酸性的降低抑菌活性呈现增加的趋势，在中性和碱性（ pH712）条件下，随着碱性的增加抑菌活性不断降低；随着冻融次数的增加，抑菌活性略有变化； 通过 MTT 实验表明， 中华圆田螺抗菌肽 对 人 体 肺 腺癌细胞 A549 的生长抑制作用随着浓度的增加而加强。 本实验成功筛选到 中华圆田螺 抗菌肽，并检测其在体外对 人 体 肺 腺 癌细胞 A549 具有抑制生长作用。 关键词 ：抗菌肽 ； 中华圆 田螺 ； 抗菌
3、效 ； ， 理化特性 ； 抑癌 活性 Bacteriostatic Effect of Antibacterial Peptide from Cipangopaludina Cathayensis and the Determination of Physical and Chemical Properties and Tumor-suppressor Activity YANG Li-li1,WANG Bin1,ZHU Hua-hua2,LI Yu-ping1,LIU Jian-tiao1,* (1. College of Life Science, Jiangxi Science and
4、Technology University, Nanchang 330000, Jiangxi， China; 2. Reliance Biological Engineering Limited Company, Shenzhen 518000,Guangdong， China ) Abstract: To screen the antibacterial peptide from the cipangopaludina cathayensis and test its antiproliferative effects. This study extracts antibacterial
5、peptide preliminary from cipangopaludina cathayensis and determines its antibacterial effects, physical and chemical properties. The human lung adenocarcinoma cell line A549 be used as the model in vitro. MTT, mitotic index experiment and clone formation experiment be adopted to study the inhibition
6、 effect of antibiotic peptide. the bacteriostatic effect of the crude extraction is obvious; with the treating temperature increasing, treatment time extending, antimicrobial activity reduce gradually, but still show good thermal stability; Under the weak acidity (pH 4-6)conditions, antibacterial ac
7、tivity tended to increase as the acidity reduces. Under the neutral and alkaline (pH 7-12) conditions, antibacterial activity reduces as the alkalinity increases; With freezing and thawing times increasing, antibacterial activity changes slightly; crude extraction shows inhibition to human lung aden
8、ocarcinoma cell line A549 cells proliferation. The antibiotic peptide from cipangopaludina cathayensis has significant inhibition effect on human lung adenocarcinoma cell line A549. Key words: antibacterial peptide; cipangopaludina cathayensis; effect of antibiosis; physicochemical property; tumor-s
9、uppressor activity 抗菌肽是一类免疫效应因子，它在生物机体的先天免疫系统中起到重要的作用 1，具有广谱抗菌、抗寄生虫、抗病毒、抗癌、抗氧化等多种生物学活性 2。迄今为止，已有 2000 多种被分离纯化 。 其抗癌作用的机理主要包括：细胞杀伤作用、诱导细胞凋亡、影响信号转导、抗肿瘤转移作用等 3-7。由于抗菌肽具有低毒或无毒，对癌细胞一定的特异选择的特点， 使得人们越来越关注于抗菌肽的研究。 基金项目： 江西省教育厅青年科学基金项目（ GJJ10242） ； 江西科技师范 大学 校级重点项目（ KYZ2008ZZ） ； 江西科技师范学院大学生创业、科研项目 作者简介：杨丽丽（
10、1989 ），女 （ 汉 ） ，本科，研究方向：生物工程 。 *通 信作者 2 中华圆田螺，学名 Cipangopaludina cahayensis，俗名田螺、香螺，英文名 Mudsnail。属软体动物门、腹足纲、田螺科、 圆田螺属，广泛分布各地，淡水湖泊、水库、稻田、池塘沟渠等，一年四季生产 8。中华圆田螺营养丰富且具有一定的药效作用，在本草拾遗中记载：煮食之，利大小便，去腹中结热，目下黄，脚气冲上，小腹结硬，小便赤涩，脚手浮肿；生浸取汁饮之，止消渴；碎其肉敷热疮 9。 目前对中华圆田螺的研究和资源开发利用主要集中在饲养和营养价值的研究，但对其体内的抗菌肽的分离、纯化及其抗癌生物活性作用的
11、研究至今未见报道。因此，本研究以中华圆田螺为研究对象，并对其体内的抗菌肽进行研究。 1 材料及方法 1.1 材料与 仪器 中华圆田螺 购自 南昌墩子塘市场 ； 人体肺腺癌细胞 A549 cell和 大肠杆菌（ Escherichia coli） K12D31菌株本实验室保存 ； 抑酶肽 、 苯基硫脲 ， 蛋白胨 、 酵母提取物 、 琼脂粉 购自 Sigma 公司 ； NaCl、 HCl、 NaOH购自广州化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。 生物安全柜 ： 苏州安泰空气技术有限公司 ； D-37520 冷冻离心机 ： 德国 Thermo 公司 ； 微量移液器 ：德国 Eppendorf 公司 ；
12、生化培养箱 ： 上海博讯实业有限公司 ； 蒸汽灭菌器 ： 上海博讯实业有限公司 。 1.2 实验 方法 1.2.1 中华圆田螺的饲养 将市场上 买来的 中华圆田螺 用清水饲养 4 d5 d。每天换一次清水。 1.2.2 抗菌物质粗提液的制备 取中华圆田螺，用报纸将其沥干。 注射入少量大肠杆菌，诱导其产生抗菌肽， 8 h 后 将其尾部螺纹敲碎，挤压螺口，使血淋巴流入预冷并加有苯基硫脲（ 20 mol/L）与抑酶肽（ 20 g/mL）的离心管中。然后在冰水浴中将螺壳敲碎，用剪刀剪碎螺肉，收集流出的液体。合并两次的液体。 将收集到的液体于 4 ， 10 000 r/min，离心 30 min，取上清
13、，将上清液放入沸水浴中加热 10 min后 ，立刻再次放入冰水浴中冷却。将处理 后的样品于 4 ， 10 000 r/min，离心 30 min，取上清液，即得粗提液 4-5。 1.2.3 抑菌活性测定 抑菌活性测定的步骤如下：将指示菌转接到新鲜的液体培养基中，剧烈振荡培养至 OD600=0.40.6，然后按 1 %的比例加入到含 1 %琼脂的固体培养基中，充分混匀，再迅速倒入平皿中。待培养基冷却后，用打孔器在琼脂板上打孔（直径为 7 mm）。以无菌水与苯基硫脲、抑酶肽作为对照，每孔 60 uL， 37 培养 1d2d，抑菌活性用抑菌圈直径表示（抑菌圈直径 =总直径 孔直径），每组实验重复 5
14、 次 6-7 。 1.2.4 抗菌物质的理化性质 1.2.4.1 温度对抗菌物质的抑菌活性影响 取粗提液在 50、 80、 100 下分别处理， 50、 80、 100 的处理时间分别为： 10、 20、 30、 45、 60、80、 100 min。处理之后的样品立即于 4 ， 10 000 r/min，离心 20 min，取上清测定其抗菌活性，每组实验重复 5 次。 1.2.4.2 pH 对抗菌物质的抑菌活性影响 用 HCl 和 NaOH 将粗提液的 pH值分别调为 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 和 12，迅速混匀并静置 30 min 后， 4 10 000r/min
15、离心 5 min，取上清 ， 测定其抗菌活性，每组实验重复 5 次。 1.2.4.3 不同冻融次数对抗菌物质的抑菌活性影响 取 100 uL 粗提液，在 -20 冷冻， 25 下解冻，冻融次数分别为 5、 10、 15 和 20 次，分别检测抑菌活性，以 0 处理次数为对照，每组实验重复 5 次 10。 1.2.5 抑癌活性测定 选取对数生长期的 人 体 肺 腺 癌细胞 A549 细胞，然后用 0.25 胰蛋白酶消化，后用含 10 FBS 的RPMI1640 培养液制成 5104 个细胞 mL，并接种于 96 孔板中，每孔 100 uL。接种完成后置 37 5 %CO2培养箱中培养 24 h，
16、吸去上清。对照组：加入同体积的无添加福寿螺多糖的培养液 100 uL；试验组 ：分别加入含有终浓度为 20、 50、 100、 200 ug/mL 的多糖培养液 100 uL，每种浓度均 4 个平行样品，继续3 培养 4、 8、 24 h 后，及时更换新培养液，在每孔加入含 5 mg/ml MTT 的无 Ca2+、 Mg2+的 PBS 液 20 uL，37 继续培养 4h，除去上清，每孔加碱化二甲基亚砜 150 uL， 37 温育 30 min，时不时轻微振荡，完全溶解后，用酶标仪测定吸光度（ A）值（ 570 nm）按 如下公式计算：抑瘤率 =（对照组 A 值一实验组A 值）对照组 A 值
17、100 2 结果及 讨论 2.1 粗提液抑菌效果 粗提液抑菌效果 ， 见 表 1. 表 1 粗提液抑菌效果测定 Table 1 Antibacterial effect of crude extract 试液 抑菌圈直径 /mm 粗提液 8.90.89 无菌水与苯基硫脲、抑酶肽混合液 0 由表 1 可知，粗提液抑菌效果明显。而空白对照组则没有明显的抗菌效果。 2.2 温度对抗菌物 质抑菌活性的影响 温度对抗菌物质抑菌活性的影响 ，见表 2. 表 2 不同温度不同处理时间对抗菌物质抑菌活性的影响 Table 2 Effect of different temperature and time o
18、n the antibacterial of crude extract 时间 /min 抑菌圈直径 /mm 50 80 100 10 7.31.04 7.31.04 5.70.29 20 7.20.76 6.80.29 5.00.50 30 7.00.50 6.70.29 4.70.29 45 6.70.76 6.30.29 3.30.29 60 6.70.76 6.30.76 2.70.29 80 6.20.29 6.21.15 2.50.50 100 6.00.50 5.80.58 2.00.50 由表 2 可知，粗提液经 50 、 80 水浴处理，抗菌肽抑菌活性影响不大。而经 100
19、水浴处理，在前 30 min 内粗提液的抑菌活性影响不大，水浴处理达到或超过 45 min 时活性开始显著降低。 在 100 min 内的各个相同时间段内， 50 水浴处理粗提液的抑菌活性与 80 水浴处理的抑菌活性相差不显著，而 100 水浴处理粗提液的抑菌活性则与以上两个温度处理的抑菌活性相差悬殊。 总体而言，随着处理温度的升高，处理时间的延长粗提液的抑菌活性呈现逐步降低的趋势。但实验结果仍表明，粗提液的抗菌物质具有较好热稳定性。 2.3 pH 抗菌物质抑菌活性的影响 pH 抗菌物质抑菌活性的影响 ，见表 3。 表 3 不同 pH 对抗菌物质抑菌活性的影响 Table 3 Effect o
20、f different pH on the antibacterial of crude extract pH 抑菌圈直径 4 /mm 4 9.00.94 5 10.20.45 6 12.20.84 7 8.60.89 8 8.70.84 9 7.70.76 10 7.60.89 11 8.01.0 12 5.50.35 实验过程中发现，粗提液的 pH 在 4 与 5 之间。而且粗提液的抑菌圈直径也介于 pH4 和 5 的抑菌圈直径之间。当 pH 为 6 时，粗提液的抑菌活性达到最大。在弱酸性（ pH46）条件下，随着酸性的降低粗提液的抑菌活性呈现增加的趋势，而且差别明显。在中性和碱性（ pH
21、712）条件下，随着碱性的增加粗提液的抑菌活性不断降低， pH 达到 12 时，粗提液的抑菌活性明显下降（见表 3），说明在弱酸性下能促进中华圆田螺产生的抗菌物质的活性，在碱性条件下其受影响较大。 2.4 不同冻融次数对抗菌物质的抑菌活性影响 不同冻融次数对抗菌物质的抑菌活性影响 ， 见表 4。 随着冻融次数的增加，粗提液的抑菌活性略有变化，但各处理组与对照组之间差异不显著，说明 中华圆田螺 产生的抗菌物质在冻融的情况下比较稳定 。 表 4 不同冻融次数对 粗提液 抑菌活性的影响 Table 4 Effect of different freezing and thawing cycle on
22、 the antibacterial of crude extract 冻融次数 5 10 15 20 0 抑菌圈直径 /mm 8.00.54 7.50.5 7.00.14 7.00.22 8.90.89 2.5 抑癌活性测定 已知活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臜（ formation），该物质沉在细胞中，但是死细胞没有这样的功能。在一定细胞数范围内， MTT 结晶物形成的量与细胞数呈正比。本实验通过该方法，用酶标仪测定在 570 nm 波长处各组分 A549cell 的光度值，间接反映其活细胞数量 ， 结果 见表 5. 表 5 粗提液 对 A54
23、9cell 细胞体外增值的影响 Table 5 Effect of crude extract on proliferation of A549 in vitro 浓度 /（ um/mL） 4 h 8 h 24 h 0 0.3600.013 0.3720.015 0.4100.016 20 0.3240.013 0.3110.012 0.2830.019 50 0.3050.015 0.2870.012 0.2340.017 100 0.2660.018 0.2530.017 0.2210.020 200 0.2150.021 0.2010.014 0.1750.012 表 5 结果显示，随着
24、 抗菌物质 浓度的增加或作用时间的延长，各组 A549cell 的吸光度值相对减小，间接说明其活细胞数量也随之减少，体现出中华圆田螺 抗菌物质 对 A549cell 的增殖的确有抑制作用。从实验结果中得出，相同浓度的中华圆田螺 抗菌物质 对 A549cell 增殖的抑制效应随着作用时间的延长而增强，不 同 浓度中华圆田螺 抗菌物质 在作用时间相同的 情况下，随处理浓度增加对 A549cell 增殖的抑制效应增强。 5 3.结论与讨论 抗菌肽作为一种非特异性免疫分子，具有广谱高效抗菌 及对肿瘤细胞有广谱杀伤作用 活性。 抗菌肽由于其特殊的抗肿瘤机制 ,不易产生耐药性 ,以及对哺乳动物正常细胞毒性
25、较低等特点 ,已经成为抗肿瘤药物研发的热点之一。 目前，人们 在 不同的生物中 都 发现了抗菌肽。 但抗菌肽的研究开发中还是有一些亟需解决的问题，如来源问题。本文以中华圆田螺为研究对象，可为抗菌肽的来源提供了一种可行的方式。 本研究利用大肠杆菌诱导，使中华圆田螺血淋巴产生具有抗菌活性的物质 ，经加热 处理 等方法初步分离得到含有抗菌肽的粗提液，该抗菌肽是一种具有较强热稳定性的偏碱性小分子蛋白。经研究显示，室温放置短时间及反复冻融对抗菌活性无明显影响， 对人 体 肺 腺 癌细胞 A549的增殖具有一定的抑制作用，表明该抗菌肽具有一定的抑癌作用。这与 从其他的动物中提取的抗菌肽 具有 相似性，如刘
26、红玉等发现从中国林蛙中提取的抗菌肽对 人胃癌细胞 SGC7901生长具有抑制作用 12， 陈丽萍等发现 中华大蟾蜍 中的抗菌肽对 人大肠癌细胞 SW480的 生长具有抑制作用 13。 目前我们正在对所诱导的 中华圆田螺 抗菌物质作进一步的分离纯 化 ，以便找到该抗菌肽或抗菌蛋白的基因。 参考文献 1 Lai Y, Gallo RL， AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense J. Trends Immunol, 2009, 30(3): 131-141 2 Steine
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