1、吉 林 化 工 学 院生 物 工 程 专 业 实 验 报 告实验题目：四环素族抗生素定向发酵Tetracycline antibiotics directional fermentation课程类型： 生物工程专业实验 实验类型： 设计型专业班级： 学生姓名： 学生学号：合作者： 指导教师：提交日期： 2015 年 11 月 23 日吉 林 化 工 学 院Jilin Institute of Chemical Technology0四环素族抗生素定向发酵实验摘要：通过金色链丝菌在不同培养基中产生不同的产物，了解定向发酵的意义。另外通过实验更进一步学会根据抗生素生物合成的不同途径寻找各种抑制剂或
2、促进剂，以调节某些酶的活性,从而改变代谢途径。四环素和金霉素都能在酸性条件下加热生成黄色脱水四环素和脱水金霉素其产生黄色的深浅与它们的含量多少成正比。所以通过反应比色即可知道二者地总含量（预先要做好四环素浓度的标准曲线），称其为总效价。关键词：金色链丝菌、定向发酵、四环素族抗生素、金霉素、总效价前言：定向发酵是指通过改变培养基的组分(如加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的某种产物。金色链丝菌能同时产生四环素和金霉素，这二种抗生素在分子结构上只是在第七位上差一个氯离子。四环素族抗生素族抗生素包括金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：当 R1 为 Cl,R2 为
3、H 时分子为金霉素；当 R1 和 R2 都为 H 时为四环素；当R1 为 H，R2 为 OH 时为土霉素（羟基四环素）。金霉素比四环素只多一个氯离子，只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。从生物合成途径上可知四环素和金霉素有一段相同的生物合成途径，到某一个中间产物时，氯化酶活力的大小可能决定其合成途径的改变，所以我们设计从控制氯化酶的活性和氯化酶的量来影响菌种的代谢途径，从而得到不同的产物。本实验是通过在改变培养基的组分，来实现定向发酵。我们从下面两个方面考虑:1（1）抑制氯化酶的活力利用硫醇基苯骈噻唑（M-促进剂）与氯化酶的激活剂二价铜离子作用，降
4、低铜离子的浓度，从而使氯化酶的活力下降。（2）利用竞争性抑制剂来减少氯化酶的量加入一种基质，其能与某一反应的酶作用，使此反应的酶量减少，从而使此反应受到抑制的现象一般称竞争抑制。本实验利用溴离子在生物合成中对氯离子有竞争性抑制作用的原理。据研究四环素与金霉素有一共同的代谢分叉的间体，此中间体进一步的代谢方向取决于不同酶活力的大小，其示意图见（图 31）图 31 四环素和金霉素分叉代谢示意图图 31 中 A 为四环素和金霉素的代谢分叉中间体，在此之前，四环素和金霉素的代谢途径相同，A 物质在 E1 酶的作用下生成 B 物质，它进一步代谢即生成四环素（TC）。A 物质在有氯离子存在时，在氯化酶 E
5、2 的作用下生成ACl，然后再在 E1 酶的作用下生成 BCl，再进一步反应即生成金霉素(CTC) 。因此，A 物质究竟向那个方向代谢，则取决于系统中氯离子与氯化酶存在的多少，所以若把氯化酶的量减少，反应就会较多的向四环素方向进行。现考虑加入溴化物作为竞争性抑制剂，因为氯化酶 E2 也可以催化溴化物的形成，从而消耗掉一些氯化酶减少金霉素的形成，在反应中也形成了一些溴四环素，但此反应速度较慢，整个反应还是形成较多四环素。此反应中随溴离子量的增加四环素量也有所增加，但随氯离子的增加四环素的量会减少。上述两个作用都有一定的局限性，第一个措施受硫醇苯骈噻唑毒性的影响，第二个措施受溴四环素的量和氯离子的
6、限制，所以在生成四环素的过程中若用金色链丝菌用作生成菌、在水中又存在氯离子时，常将两个措施一起用，以最2大限度地减少金霉素地量。2、化学法测定四环素和金霉素地原理如下：实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。四环素和金霉素都能在酸性条件下加热生成黄色脱水四环素和脱水金霉素其产生黄色的深浅与它们的含量多少成正比。所以通过反应比色即可知道二者地总含量（预先要做好四环素浓度的标准曲线），称其为总效价。在碱性条件下，金霉素不稳定，可生成无色的异金霉素，而四环素则比较稳定，然后将其在酸性条件下产生的黄色，比色测出的即为四环素的量。将测出的总效价值减去四环素的效价值即为金霉素的效价。金霉素 异金霉素发酵液
7、中，由于杂质的干扰将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA ）作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)可以减少杂质对比色反应的干扰。本实验用一支金色链丝菌在加入氯离子、硫醇基苯骈噻唑和溴化钠等物质的作用下看四环素和金霉素的产生量的多少，来验证上述原理和措施。通过培养基的配制和接种、发酵最后通过化学手段测定四环素和金霉素的3效价，本实验因为培养时间较长学生实验可分二次进行。1 实验内容：配制种子培养基和四种发酵培养基、接种子、转发酵。放瓶；测效价；利用比色法测定四环素和金霉素的效价。2 实验材料和仪器：1、金色链丝菌菌种（由实验室提供）。旋转式
8、摇床：转速 230 转/分。2、培养基原材料；（1）种子培养基配方：花生饼粉 2 (20g/L)；淀粉 4 (40g/L)；酵母粉 0.5 ；蛋白胨 0.5 ；硫酸胺 0.3 ；硫酸镁 0.025 %；磷酸二氢钾0.025 %；碳酸钙 0.4 %；PH 自然。（2）发酵培养基配方：花生饼粉 4 (40g/L)；淀粉 10 ；酵母粉 0.2 ；蛋白胨 1.4；硫酸胺 0.25 ；硫酸镁 0.25 %；淀粉酶 0.02 %；碳酸钙 0.5 %；pH 自然。EDTA 试剂，取乙二胺四乙酸二钠盐 4.5 克，和 NaOH 5.5 克溶解于5000ml 蒸馏水中。固体草酸、乙二胺四醋酸二钠盐（EDTA）
9、混合试剂、4 N 盐酸、721 分光光度计3 实验步骤：（1）配种子培养基，配制时淀粉要先糊化。配置 100ml , 取 30 ml，250ml 三角瓶中八层纱布，外加牛皮纸。（2）接种：种子培养基消毒后冷却，在无菌室中将金色链丝菌斜面挖一小块放入培养基中然后放在旋转式摇床上 28培养 20 小时。（3）配发酵培养基：先将所需淀粉糊化后冷却至 60左右，加入 淀粉酶。在 60水浴中保温 1020 分钟待淀粉液化后在把其它成分放入。（4）将配好的发酵培养基分成四分分别编号：配置 200ml , 分别取 4 次，每次 40 ml，放置 250ml 三角瓶中八层纱布，外加牛皮纸。1 对照（即为上述培
10、养基）2 加入 0.3溴化钠43 加入 0.3%氯化钾4 加入 0.3%溴化钠和 0.0015%M-促进剂（M促进剂的原始浓度为0.05%）（5）接发酵:种子长好后（不染菌、种子液较粘稠、菌丝粗壮）接入发酵培养基，接种量为 10 。再放入摇床转速 220-230r/min，28 培养 5 天。4 标准曲线绘制标准溶液配制，精确称取四环素标准品，若干毫克溶于 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，配制成四环素标准溶液，使溶液浓度为 1000 U/ml 左右标准曲线绘制， 分别吸取上述标准溶液，1.0 ml, 0.8 ml.0.6 ml,0.4 ml,0.2 ml 于 50ml 容量瓶中， 加
11、 EDTA 混合试剂 11 ml ,放置 5 min 后，再加2.0 mol/L HCL 4 ml 与此同时，另外做 5 只空白样品，操作方法相同，然后将空白样品直接用蒸馏水稀释至刻度，而样品放在沸水中加热 5 min ,冷却后，测定的吸光度 A440为纵坐标，作标准曲线。1、放瓶：摇瓶从摇床上拿下来后应进行下列参数的测试与观察：pH、 颜色、粘度、气味及虑速等实验数据。2、固体草酸调 pH 至 1.5-2.0，调试过程中要充分摇匀，避免过酸。3、滤得滤液。4、四环素效价得测定：取滤液 0.3-0.5ml（视效价高低而定）放入 50ml 容量瓶中加入 EDTA混合试剂（含 NaOH）11ml放
12、置 5 分钟加 2mol/L 盐酸 4ml煮沸 5 分钟迅速冷却后，用蒸馏水稀释至刻度用分光光度计上 440nm 波长下比色，测得光密度值 A440后查标准曲线即可得四环素的效价。四个样品均按上法测试，每个样品均需单独做对照对照做法同上只是取消加热直接稀释，比色时一一对应。终止发酵过程记录终止发酵时间，摇床转速，摇床温度。记录发酵液的粘度（挂瓶程度）；颜色；气味；;pH 值；镜检菌丝体（留照片）。固体草酸调 pH 至 1.5-2.0，调试过程中要充分摇匀，避免过酸。用 250ml 塑料离心杯，每杯装入两个平行发酵瓶中的发酵液。用 5000 转/分离心-5 分钟，取其上清液。5四环素效价测定四环
13、素的吸光度= 总吸光度- 对照（底色）吸光度。对照（底色）吸光度分析样品制备法使用移液管取离心上清液 2ml 放入 50 ml 容量瓶中加入 EDTA 混合试剂（含 NaOH）11ml摇匀后放置 5 分钟加 2mol/L 盐酸4ml，摇匀，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用酶标仪测定底色吸光度。总吸光度分析样品的制备法使用移液管取离心上清液 2ml 放入 50 ml 容量瓶中加入 EDTA 混合试剂（含 NaOH）11ml摇匀后放置 5 分钟加 2mol/L 盐酸 4ml，摇匀（别激动现在不定容）煮沸 5 分钟迅速冷却后，再用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，。酶标仪测定总吸光度。四个样品均按上法测试，每个样
14、品均需单独做对照，对照样做法同上只是取消加热直接稀释。比色时其位置要一一对应，以便于计算。总效价的测定总效价吸光度 = 总吸光度- 对照（底色）吸光度。总效价总吸光度分析样品的制备法：取发酵液离心上清液 2ml 加入50ml 容量瓶中加入蒸馏水 11ml，摇匀。加入 2mol/L 盐酸 4ml，摇匀。 煮沸 5 分钟迅速冷却后稀释至 50ml，摇匀。酶标仪测总效价。方法同上只是不加热直接稀释。（2）总效价对照（底色）吸光度分析样品制备法：取发酵液离心上清液 2ml 加入 50ml 容量瓶中加入蒸馏水 11ml，摇匀。加入 2mol/L 盐酸4ml，摇匀。 直接用蒸馏水稀释至 50ml，摇匀。酶
15、标仪测总效价。5 总效价的测定取滤液 0.3-0.5ml 加入 50ml 容量瓶中加入蒸馏水 11ml加入2mol/L 盐酸 4ml煮沸 5 分钟迅速冷却后稀释至 50ml用 440nm 波长下比色，所得光密度查标准曲线即得各样品的总效价，各样品也要做对照。方法同上只是不加热直接稀释。66 结果发酵时间=5 天 摇床转速=210r/min 摇床温度=28数据 第一组 第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）发酵液粘度 适中 适中 适中 较粘稠有明显挂壁现象颜色 黄色 黄色 黄褐色 褐色气味 无明显刺激性气味无明显刺激性气味稍微有点酸气 无明显刺激性气味效价数据记录总效价吸光度 = 总吸
16、光度- 对照（底色）吸光度。四环素的吸光度= 总吸光度- 对照（底色）吸光度。数据 OD第一组 第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）四环素效价（对照）0.126 0.074 0.082 0.117四环素效价 0.176 0.132 0.117 0.217总效价(对照） 0.176 0.076 0.128 0.083总效价 0.235 0.143 0.208 0.204结果计算组别OD第一组 第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）四环素效价 0.050 0.058 0.035 0.1总效价 0.059 0.067 0.08 0.1217分别将四环素效价和总效价的 OD 值带
17、入四环素效价标准曲线y=3.8756x 里面可得OD效价第一组 第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）四环素效价0.19378 0.2248370.13567750.38765总效价 0.22871 0.25973 0.31012 0.4691数据效价第一组 第二组（溴化钠）第三组（氯化钾）第四组（促进剂）金霉素效价0.03493 0.0348930.17444 0.08145四环素是两性化合物，等电点是 5.4，而蛋白质的等电点也在 5.3 左右。如果将 PH 调至 5.4，蛋白质也会沉降，起不到分离目的。而四环素类抗生8素在 4.0-7.0（这两个数字不是很准确，待确定）之内均能
18、沉淀，故调至4.5-4.6。另外四环素类抗生素在 PH5.0 时，不是很稳定，所以调 PH 时用比较弱的碱氨水。实验中，因为操作原因导致实验有误差，其中三号试验品略微有染菌的迹象发生。但总体来说还在可控的实验误差范围之内根据图表结果可以看出加入 0.3%溴化钠和 0.0015%M-促进剂的实验组在四环素方面有明显的提升，有助于菌种对四环素的分泌和生产，而其他两组并没有明显的提升。试验后我们经网上查询发现金色链霉菌经溶菌酶处理形成的原生质体细胞，可增大对紫外线的敏感性。选育出的菌株 H32-37 是一株形态上变异较大的高产菌株，四环素生产效价可稳定在 26000r/ml，较出发菌株提高了 44.4%。其发酵性能较好且遗传性稳定，具有一定的生产应用前景。据结果表格可知加入 0.3溴化钠和 0.3%氯化钾和 0.3%溴化钠和0.0015%M-促进剂均对四环素的效价有明显提升，其中加入 0.3%溴化钠和0.0015%M-促进剂的提升最高。另外加入 0.3%氯化钾对于金霉素的效价提升最高
