1、Comment A1: 这个需要测好。可能是 1l也可能是 4l。还可以是300ng-3g。Comment A2: ？10 秒钟，离心到管壁无水挂即可。Comment A3: -20保存备用。地高辛标记探针的 Southern 杂交（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany）1. 探针标记步骤（20l 体系）：1) 将 10ng-1g模板 DNA用无菌去离子水补足至 16l。2) 沸水浴或干浴锅 98 10 分钟，使
2、 DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3) 充分混匀 DIG-high Primer （1#管） ，并取 4 l至变性 DNA管，混匀并离心。4) 37 温育 1小时或过夜（最大到不超过 20小时） 。5) 停止反应，加 2 l 0.2M EDTA（pH 8.0）或 65 加热 10分钟。2. 探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的 control DNA作对照标准，120固定 30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按 BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下：1) 根据表 1 DI
3、G-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到 1ng/l，将试剂盒提供的 control DNA稀释到1ng/l (原始浓度是 5ng /l)，然后按照表 2作一系列的稀释探针及control DNA表 1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量Template DNA 1 h 20 h10 ng 45 ng 600 ng30 ng 130 ng 1050 ng100 ng 270 ng 1500 ng300 ng 450 ng 2000 ng1000 ng 850 ng 2300 ng3000 ng 1350
4、ng 2650 ngComment A4: 总的稀释比例是：1:105表 2 探针 DNA及 Control DNA 系列表Tube DNA (l) From Tube #DNA dilution buffer(l)Dilution Final concentration1 Diluted orginal1ng/l2 2 1 198 1:100 10 pg/l3 15 2 35 1:3.3 3 pg/l4 5 2 45 1:10 1 pg/l5 5 3 45 1:10 0.3 pg/l6 5 4 45 1:10 0.1 pg/l7 5 5 45 1:10 0.03 pg/l8 5 6 45 1
5、:10 0.01 pg/l9 0 - 50 - 02) 将上述稀释的 2-9 号管的 control DNA 及探针 DNA各取 1l 点膜3) 120固定 30分钟或紫外交链 3-5分钟4) 将膜放入装有 20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡 2分钟5) 将膜放入 10ml Blocking solution中室温温育 30分钟6) 将膜放入 10ml Antibody solution 中室温温育 30分钟7) 用 10ml Washing buffer 洗 2次，每次 15分钟8) 在 10ml Detection buffer 平衡 2-5分钟9) 将
6、膜放入 2ml 新配制的 Color substrate solution 中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡10)当斑点或带显示出来后，用 50ml灭菌的双蒸水洗膜 5分钟，照相染色至 0.1pg的 Control DNA出现斑点，比较标记的探针与 Control DNA 染色情况计算出地高辛标记的 DNA 的量：如果 0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果 0.1pg的对照显色， 0.1pg的标记探针没显色，但Comment A5: Capillary transfer1%琼脂糖凝胶，40V 电泳过夜，切角标记。对于植物基因组，去嘌呤实验不要超过 20min。Co
7、mment A6: partial depurinationComment A7: 溴酚蓝Comment A8: Note: do not put ethidium bromide into the gel or the running buffer.量要少：Up to 10 g of plant genomic DNA per lane0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的 1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml 杂交液） ；如果 0.1pg的对照显色，但标记探针 0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。（转膜被省略。 ）去嘌呤缓冲液：place the gel in
8、 a plastic tray.cover with 250 mM HCl.agitate gently until the bromophenol blue dye turns yellow (5 minutes).agitate a further 15 minutes and rinse with distilled water.碱变性液：1.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L NaOH中和液：0.5 mol/L Tris-HCL(pH=8.0),1.5 mol/L NaCl20SSC：2 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬酸钠（pH=7.0）2SSC：0.3
9、mol/L NaCl, 0.03 mol/L 柠檬酸钠（pH=7.0）关于凝胶处理：1，凝胶放入大培养皿，加变性液没过凝胶，脱色摇床轻微摇动，1h，期间更换一次变性液；2，倾倒变性液，用无菌超纯水漂洗一次；3， （先清洗培养皿） ，加中和液，脱色摇床轻微摇动，1h，期间更换一次中和液；关于印记：1，取方玻璃盘，加入适量 20SSC；2，在方盘上架一玻璃板（注意清洁） ，玻璃板上铺一 Whatman 3MM 滤纸，Comment A9: Note: Whatman 3MM paper, paper towels should be cut slightly bigger than gel siz
10、e to avoid wicking.Comment A10: 15-20rpm两端没入 20SSC中，滤纸和玻璃板之间不要留有气泡；3，取中和后的凝胶，点样孔向下地放在 Whatman 3MM滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡；4，剪一块与胶大小一致的尼龙膜（带正电荷） ，放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉；5，将膜转入 20SSC中浸泡 5min；6，将浸润的膜准确地盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不再移动；7，将两张与膜大小相同的 Whatman 3MM滤纸置于 2SSC溶液中浸润，盖在膜上，排除气泡；8，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，吸水纸上放一块大小合宜的玻璃板，玻璃板上
11、压 0.5kg重物，水平放置，转移 12-20h；9，取下吸水纸及滤纸，揭去胶，将尼龙膜于 2SSC中浸泡 5min，再置于滤纸上吸干；10，用滤纸包好印迹膜，DNA 面朝上，置于紫外交联仪中紫外照射 2min，将DNA交联在尼龙膜上，4保存备用。Note: Do not allow the membrane to dry at any time in following procedures注意，滤膜以下任何实验中都不应干燥。3. 预杂交和杂交准备：（1）DIG Easy Hyb：将 64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂 7#瓶，37摇动溶解 5分钟；（2）计算杂交温度：通常为 37-42
12、，计算公式为：Tm=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)Topt.=Tm-20 to 25 For sequences that are 100 bp 80% Average (40%) 0.5x SSC + 0.1% SDS Approx. 60C*80100% High (50%) 0.1x SSC + 0.1% SDS 68C* Exact temperature must be determined empirically.5. 检测（注意：为避免膜变干，在下一步试剂准备好之前不要将上一步的试剂倒掉）1)
13、 杂交和洗膜后，用 Maleic acid buffer浸泡 1-5分钟2) 准备 1Block solution： 用 Maleic acid buffer 10稀释试剂6#（10Blocking solution ） ，成 1的工作液，即每 9ml Maleic acid buffer中加入 1ml 10Blocking solution 混匀，现配现用Comment A18: 就是说我们要将尼龙膜放入 100mlComment A19: Tip: This blocking step can last up to 3 hours without affecting results.Com
14、ment A20: 100mlComment A21: 或者取 200 ul到10mlComment A22: Note: If you want to reprobe the membrane, store the membrane in TE buffer until you can strip it.3) 按 1ml/ cm2 的量取用 1Block solution，处理膜 30-60分钟4) 将 4#试剂离心，按 1：5000 或 1：10000 加入 1Blocking solution，2-8可放 12小时（每 10ml 1Blocking solution 加 1ul Ab抗体
15、即可）5) 按 20 ml/100 cm2 的量用 antibody solution处理膜 30分钟6) 每次按 1ml/ cm2 的量用 Washing buffer洗膜 2次，每次 15分钟7) 按 20 ml/100 cm2 的用量，膜在 detection buffer中平衡 2-5分钟8) 准备 Color-substrate solution（显色液）：从试剂 5#中取 100ul到 5ml Detection buffer，要避光，现配现用9) 按 10ml/100cm2 的量加入新鲜配制的 color solution浸润膜，放在塑料袋或塑料盒中，保持黑暗，注意不要在显色过程
16、中摇动10) 颜色沉淀在几分钟内开始出现，在 16小时内完成显色反应，在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次。当预期的斑点出现时，可在 50ml TE buffer或无菌超纯水中洗膜 5分钟中止反应11) 照像记录结果。6. 杂交膜的再生杂交后的膜必须保持湿润，否则再生效果会受影响。以下操作必须在通风橱中进行：1) 将水浴锅调到 50-602) 将膜放入烧杯中，加入 DMF湿润后，置于水浴锅中，不断摇晃。期间要换几次 DMF，直到蓝色消失3) 用去离子水洗膜4) 在 37条件下，用 0.2M NaOH， 0.1% SDS 的洗膜液洗两次，每次 15分钟5) 用 2SSC 平衡，可以直接用来预杂交和杂交（如果暂时不用，可将膜浸在 2SSC或马来酸溶液（Maleic acid buffer）中保持湿润，直到再次使用） 。
