1、【整理总结】关于 MTT实验总结心血啊！MTT分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的 formazan结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT还原）。还原生成的 formazan结晶可在含 50%的 N,N-二甲基甲酰胺和 20%的十二甲基磺酸钠（
2、pH 4.7）的 MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定 490 nm处的光密度 OD值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 MTT步骤如下：1：接种细胞：用含 10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100010000 个细胞接种到 96孔板，每孔体积 200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养 35 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养 35 天后，每孔加 MTT溶液（5mg/ml 用 PBS 配)20ul.继续孵育 4小时，终止培养，小心吸
3、弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4：比色：选择 490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。（2）避免血清干扰：一般选小于 10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。MTT实验吸光度最后要在 0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率 50的时候
4、药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到 50抑制率时候的药品浓度，就是 IC50。要点：药品 2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为 0.1，抑制率为 0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.
5、1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025 有一个公式可供参考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率抑制率=1-加药组 OD值/对照组 OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 例：用 96孔板培养 SMMC-7721肝癌做 MTT测细胞活力,应该加多少 1640培养基,多少 MTT和 DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加 DMSO之前要尽量去掉培养液，便于 DMSO溶解甲臜颗粒
6、进行比色测定一般每孔 4000个细胞为宜，既细胞浓度在 20000个/ml，MTT加 20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加 150ul DMSO，在脱色摇床上振荡 10分钟，然后测吸光值。一般要低于 IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用 1/2-1/3的 IC50，作用时间为 36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于 1%，用药后一般为 5-10%（Annexin V），细胞周期的亚 G0峰比较明显.MTT 试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105个细
7、胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证 MTT结晶形成酌量与细胞数呈 的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD值，输入 excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化
8、的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。 4.培养时间。200ul 的培养液对于 10的 45 次方的增殖期细胞来说，很难维持 68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0期而趋于静止，影响结果，我们是在 48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做 MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT比色 OD值的升高。 6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、
9、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含 15胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于 10胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。(二)实验步骤贴壁细胞： 1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待测细胞调密度至 1000-10000孔，（边缘孔用无菌 PBS填充）。2.5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常
10、在前一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7个梯度,每孔 100ul,设 3-5个复孔.建议设 5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37孵育 16-48小时，倒置显微镜下观察。 4.每孔加入 20ulMTT溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养4h。若药物与 MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS冲 2-3遍后，再加入含 MTT的培养液。 5.终止培养，小心吸去孔内培养液。 6.每孔加入 150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照
11、孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞： 1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1106/ml，按次序将补足的 1640（无血清）培养基 40ul ；加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物 10ul；细胞悬液 50ul（即 5104cell/孔），共 100ul加入到 96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100?(储存液 100 1640）。 2.置 37，5%CO2 孵育 16-48小时，倒置显微镜下观察。 3.每孔加入 10 ul MTT溶液（5 mg/ml
12、，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。（悬浮细胞推荐使用 WST-1，培养 4 h后可跳过步骤 4），直接酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值） 4.离心（1000 转 x10min），小心吸掉上清，每孔加入 100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值。 5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3复孔。(三)MTT 的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后 4oC避光保存两周内
13、有效，或配制成 5mg/ml保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在 EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当 MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的 MTT需要无菌，MTT 对菌很敏感；往 96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。 配制 MTT时用 PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方: Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44
14、g KH2PO4 0.24g 调 ph 7.4定容 1L(四)关于细胞的接种(铺板)细胞过了 30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的 OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而 MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。 细胞密度要根
15、据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105,贴壁细胞可为 103-104. 其它的声音：1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔 1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT 方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话 SD值会很大。 2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率 10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20的波动也是常见的，所以很可能是技
16、术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。 3.我做的是肿瘤细胞的 MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用 100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过 4000080000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是 6000070000/ML的浓度组的.用 40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是 48小时还是72小时. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每
17、接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV 会在 8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验： 1.吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3到 4倍，可能比较容易混匀。10ml 的离心管里面最好装 34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。 2.吸管的吸液量最好在 1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量 1ml多的吸管，总液量在 5ml左右为益。
18、3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 4.吹打次数 100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 3050 次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种 2孔反复吹打 3次，每吹打 3次后枪头垂悬与细胞悬液中 5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。） 5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左 3下，向右 3下，在往返回复 3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是 MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。(五)加入 MTT
