1、 云 南 省 教 育 厅 科 学 研 究 基 金项 目 申请书项 目 名 称： Corilagin 对血管内皮细胞 和血管平滑肌细胞的保护作用研究项 目 类 别： 科学技术 所属学科及代码： 药理学 310.47 项 目 负 责 人： 郭 英 所 在 学 校： 昆明医学院 申 请 日 期： 二零零九年四月二十日 云南省教育厅 制受理编号 填 报 说 明一、请按云南省教育厅科学研究基金项目检查、评价实施办法及云南省教育厅科研经费管理办法的有关规定，如实填写各项内容。申请项目必须符合基金资助范围；各项内容要实事求是，逐条认真填写。二、申请书填写一律采用 WORD 软件、电脑打印，纸质材料要求 A3
2、 纸双面印刷，中缝装订。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容，最多不超过 25 个汉字。研究类别根据研究内容分为人文社科和科学技术。项目性质根据研究类别而定，如研究类别为人文社科，其项目性质选基础研究、应用研究、实验与发展中一种，如研究类别为科学技术，其项目性质选基础研究、应用研究、实验与发展、R#D 成果应用、其他科技服务中的一种。所属学科及代码以学科代码表（国表）为准。研究时间开始时间填“2009 年 6 月” ；完成时间不超过 2012 年6 月。一、项目基本情况姓 名 郭 英 性 别 女 出生年月 1980 年 4 月 民族 汉学 历 硕士 学 位 硕士 专业技术职称 讲师
3、联系电话0871-531688313708840324 E-mail 项目负责人信息通讯地址 昆明市人民西路 191 号昆明医学院药理研究室 邮 政 编 码 650031研究类别 科学技术 项目性质 基础研究所属学科 药理学 学科代码 310.47起止年月 2009 年 6 月2012 年 6 月项目基本信息申请资助 0.7 万元 自筹经费单位名称合作单位信息联系人项目摘要（限 200 字）研究 corilagin 对 OX-LDL 所致内皮细胞损伤、VSMC 增殖和迁移及 tPA 和PAI-1 活性的影响；探索 corilagin 对 tPA 和 PAI-1 蛋白及 mRNA 表达的影响，
4、阐明 corilagin 抗动脉粥样硬化作用的细胞分子机制。为将其研究成为自主创新和滇产植物来源的防治动脉粥样硬化新药提供科学依据。培养 1 名硕士研究生，提升青年教师的创新能力。发表 2 到 3 篇研究论文。二、项目组情况序号 姓名 出生年月 性别 职称/学位 从事专业 所在单位 课题分工投入时间（月） 签名1 郭 英 1980.4 女 讲 师/硕士 药理学 昆明医学院 主 持 82 沈志强 1965.10 男 教授博士 药理学 昆明医学院 指导并参与 6 4 张小超 1982.9 女 在读研究生 药理学 昆明医学院 参加实验 6总人数 5 高级 中级 初级 博士生 硕士生 本科生注：1、项
5、目组人员不得超过 5 人，其中包括项目负责人。2、签名不得使用打印或印刷体。三、研究依据及意义按以下主要提纲逐项填写：（1）研究的意义；（2）国内外研究现状、水平和发展趋势；（3）立论依据。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。目前被普遍接受的 Ross 修正的“损伤反应”学说 1认为，内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化形成早期的始动环节。血管内皮细胞损伤、血脂沉积、血小板粘附、血管平滑肌细胞增殖等多种因素的相互作用，最终形成动脉粥样硬化。越来越多的证据显示氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LD
6、L)在内皮功能不全中扮演重要角色，是目前公认的致内皮细胞损伤的危险性因子之一 2。OX-LDL 可使内皮细胞皱缩，改变细胞形态和结构，破坏内皮细胞完整性，使血中单核细胞和 LDL 等成分易于进入内皮下层 3；OX-LDL 还抑制内皮的再生和内皮细胞的迁移，不利于血管修复。同时，OX-LDL促分裂原作用促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 增殖和移行。OX-LDL 的这些作用在动脉粥样硬化中具有重要意义。临床研究发现冠心病患者血浆 OX-LDL 水平明显高于对照组，但两者之间的脂质水平无差异，提示 OX-LDL 水平独立于其它危险因素之外 4。纤
7、溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) 作为纤溶酶原活化过程的重要调节者,不仅影响血栓形成，而且还参与平滑肌细胞增殖迁移和细胞外基质积聚等动脉粥样硬化的基本病理过程，在动脉粥样硬化的发生、发展中具有相当重要的地位。近年研究发现，人动脉粥样硬化血管中 PAI-1 表达增强，动脉粥样硬化的血管壁中 PAI-1 mRNA 表达也明显上调，且 PAI-1 mRNA 水平与动脉粥样硬化病变程度一致 【5】 。粥样化斑块内 PAI-1 的异常表达还与平滑肌细胞的迁移和增殖密切相关 6。原位杂交研究显示 7，在动脉粥样硬化血管增厚的内膜中可见
8、到大量 PAI-1 mRNA 阳性细胞，并与病变严重程度相关，为 PAI-1 在动脉粥样硬化中的作用提供了直接证据。组织型纤溶酶原激活物（tissue type plasminogin activator，tPA）和PAI-1 是内皮细胞功能的标记蛋白。tPA 减少、PAI-1 增加是心脑血管病的一个独立危险因素。PAI-1 的升高与急性心肌梗死、动脉粥样硬化和血管再狭窄等心血管疾病关系密切 8。血管内皮细胞受到刺激或损伤时，可分泌和释放 PAI-1，并与 t-PA 结合而抑制血栓溶解。PAI-1 也是导致粥样斑块不稳定和诱发血栓形成的重要原因。PAI-1 可通过影响内皮细胞再生、新内膜形成、
9、血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质沉积等方面促进动脉粥样硬化。临床研究发现，PAI-1及其 mRNA 在动脉粥样硬化病变血管中的表达均明显增高，并与纤维蛋白原相关9。纤溶系统受损后 PAI-1 的增高对预测冠脉事件的相对危险度最高 10。由于PAI-1 在动脉粥样硬化和血栓性疾病中的重要作用，PAI-1 的表达调控受到了广泛关注，成为防治冠状动脉粥样硬化的新领域。近年来，动脉粥样硬化的发病率呈明显上升趋势且发病年龄越趋年轻化, 因而抗动脉粥样硬化药（antiatherosclerotic drugs）的研究日益受到重视。目前主要的抗动脉粥样硬化药物大多数为化学合成的调血脂药，作用方式停留在降低 L
10、DL 和升高 HDL 水平上，还可引起较多的不良反应，故临床应用存在一定的局限性。因此，寻找植物来源、安全有效及作用于新靶点的抗动脉粥样硬化药物，是目前心脑血管领域最重要的研究课题之一。Corilagin (-1-o-galloyl-3，6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-d-glucose，1-酰-3，6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖，图 1)，是从大戟科一年生草本植物叶下珠 (Phyllanthus urinaria) 提取的水溶性多酚类单体化合物 11。叶下珠在我省的资源丰富，易在山坡荒地上生长，可人工栽培。作为一种传统的中草药主要用来治疗肝炎、肠炎、痢疾、肾炎水肿等病症。
11、本课题组研究发现，从滇产叶下珠植物中获得的水溶性有效部位(PUW，含corilagin 60%) 对大鼠颈动脉血栓具有明显的溶解作用，延长兔白陶土部分凝血活酶时间（KPTT） ，促进血管内皮细胞产生 tPA，抑制血小板与中性粒细胞之间的相互作用等多种心血管活性 12,13。本课题组还发现，corilagin 能降低内皮功能损伤的家兔血浆中血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF） 、丙二醛水平，对抗血小板活化因子（PAF）对血管内皮细胞的损伤作用，同时在体外能降低血浆中 PAI-1 的活性，提示其在动脉粥样硬化的防治中具有良好的前景。目前研究发现 corilagin
12、 具有抗病毒和抗肿瘤活性 14，其心血管活性仅见本课题组等少量报道 15，而其对动脉粥样硬化的作用及机制研究则未见报道。我们的前期研究提示 corilagin 在动脉粥样硬化的防治中具有深入探索的价值。因此，本课题组在前期研究基础上，体外培养人脐静脉血管内皮细胞，观察 corilagin 抗 OX-LDL 致内皮细胞损伤作用；体外培养主动脉血管平滑肌细胞，探讨 corilagin 对 OX-LDL 引起的 VSMC 增殖和迁移的影响；检测血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中 tPA 和 PAI-1 活性的变化；采用免疫组化和 RT- PCR 方法检测 corilagin 对 tPA 和 PAI-1
13、蛋白及 mRNA 表达水平的影响。本课题将从细胞和分子水平进一步研究 corilagin 对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的保护作用及其可能的分子机制，为将其研究成为具有自主创新和云南特色植物来源的抗动脉粥样硬化药物提供科学的理论和实验依据。图 1. Corilagin 化学结构式四、研究内容按以下主要提纲逐项填写：（1）具体研究内容和重点解决的关键技术问题：1.体外培养人脐静脉血管内皮细胞，观察 corilagin 抗 OX-LDL 致内皮细胞损伤的保护作用；2.体外培养主动脉血管平滑肌细胞，观察 corilagin 对 OX-LDL 引起的 VSMC 增殖和迁移的影响；3.测定血管内皮细胞和
14、血管平滑肌细胞中 tPA 和 PAI-1 活性的变化；4.免疫组化和 RT- PCR 方法检测 corilagin 对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞tPA 和 PAI-1 蛋白及 mRNA 表达水平的影响。（2）创新点：1. 叶下珠植物在云南有丰富的资源（云南省景洪州的沙河乡、勐勐镇、临沧县均有 GAP 规范的种植基地） ，corilagin 在该植物中含量高，本课题组的提取分离技术成熟简便，本项目实施有利于滇产药用植物叶下珠的进一步开发利用。2. 本课题组研究发现，从滇产叶下珠植物中获得的单体成分 corilagin 能降低内皮功能损伤的家兔血浆中 vWF、丙二醛水平，对抗活性氧对血管内皮细胞
15、的损伤作用，同时在体外能降低血浆中 PAI-1 的活性，我们的研究结果提示其在动脉粥样硬化的防治中具有良好的前景。目前国内外研究发现，corilagin 具有良好的抗病毒和抗肿瘤活性，其心血管活性仅见本课题组等少量报道，而其对动脉粥样硬化的作用及机制研究则未见报道。3.血管内皮细胞的损伤和血管内皮细胞的增殖迁移是动脉粥样硬化发生发展的病理生理学关键基础，本项目以该两种细胞为研究对象，能较深入研究 corilagin 发挥抗动脉粥样硬化作用的关键靶细胞。4. 采用近年发现的与动脉粥样硬化形成关系密切的活性物质 OX-LDL 为诱导剂刺激血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，评价 corilagin 对目
16、前认为是动脉粥样硬化独立风险因子 tPA 和 PAI-1 的调控，有利于阐述 corilagin抗动脉粥样硬化作用的新型机制。5. 为将 corilagin 研究成为新型抗动脉粥样硬化药物提供进一步的药理学实验依据。（3）研究目标：预期目标：1. 研究 corilagin 对 OX-LDL 刺激血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的影响，探索其细胞、分子作用机制，为将其研究成为具有自主创新和滇产植物来源的抗动脉粥样硬化新型药物提供科学的药理学理论与实验依据。2. 通过项目实施，为深入研究源于滇产叶下珠药用植物的有效成分corilagin 防治动脉粥样硬化提供药理学实验依据。考核指标：1. 研究 corilagin 对 OX-LDL 刺激血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的影响，探索其细胞、分子作用机制。2. 发表研究论文 2-3 篇，其中至少 1 篇为核心期刊。3. 培养硕士研究生 1 名。4. 培养和提升药理学青年学术骨干的科研能力和创新意识。
