1、二株棉花立枯病拮抗菌的筛选与鉴定杜志兵，杜秉海，姚良同，黄伟红，丁延芹 1（山东农业大学生命科学学院，山东，泰安 271018）摘要: 从棉花根际分离了 1277 个细菌分离物，以棉花立枯病病原真菌立枯丝核菌（ Rhizoctonia solani Kuhn）为靶标菌，通过平板对峙法获得 25 个具有拮抗性能的分离物，其中 MH1 和 MH25 具有很强的拮抗性能，且拮抗性能稳定，具有较好的生防潜力。经过形态观察、生理生化特征分析及 16S rDNA 碱基序列测定和同源性分析，将 MH1 鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis） ，MH25 鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacil
2、lus subtilis） 。MH1 和 MH25 的 16S r DNA 碱基序列已在 GenBank 中注册，登陆号分别为：EF488102，EF488103。关键词: 棉花根际 拮抗 立枯病 鉴定ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ANTAGONISTIC BACTERIA INHIBITING AGAINST PANTHOGENIC FUNGI OF COTTON RHIZOSPHEREDU Zhi-bing, DING Yan-qin,YAO Liang-tong,Huang Wei-hong, DU Bing-hai(Department of micr
3、obiology, College of life science,Shandong Agricultural University, Taian 271018,China)Abstract: Twenty -five strains of antagonistic bacteria, screened from 1277 isolates of cotton rhizospere, have inhibition effect against Rhizoctonia solabni Kuhn. Based on the results of morphologic characteristi
4、cs, physiological and biochemical properties and phylogenetic analysis of 16S rDNA, MH1 was identified as Brevibacillus brevis and MH25 was identified as Bacillus subtilis. The sequences of 16S rDNA obtained in this study have been registered at GenBank database and the accession number, respectivel
5、y, are EF4488102 and EF4488103.Key Words: cotton rhizosphere, Rhizoctonia solani , antagonistic, identification棉花立枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）引起的，是世界各产棉区分布广泛，危害严重的病害，我国主要棉区都有发生，其中以黄河流域为重，现在采用合理轮作、选用抗病品种 1、施用化学农药等措施防治棉花立枯病的发生，但是轮作和筛选抗病品种周期长，使用化学农药不能从根本上防治棉花立枯病，又带来了环境污染。而生物防治的方法可以减少化学农药带来的环境污染，又
6、解决了抗病棉种筛选周期长，抗病单一的缺点，是一种行之有效的方法；此方法既限制了有害微生物生长又增加了根际有益微生物的数量。近年来虽然有棉花立枯病原菌拮抗菌的相关报道 2,3,4，但是存在着拮抗菌难以在棉花根际长期定殖的问题。本实验从棉花根际分离并筛选的拮抗菌有利于其在棉花根际的定殖。拮抗菌的应用还可以有效的促进植物的生长。本实验从高河周大庙、马集新庄、鸡黍李固堆、济宁、金乡、济宁农科院的农田中采集棉花根际土，筛选棉花立枯病的拮抗细菌，获得具有很好生防应用潜力的拮抗菌株 2 株，其中 MH1 被鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis） ，MH25 被鉴定为枯草芽孢杆菌（Ba
7、cillus subtilis） 。1通讯作者：Tel: 86-538-8242908;E-mail:基金项目：山东省优秀中青年科研奖励基金（2006BS06012）作者简介：杜志兵(1980) ,男,在读硕士，研究方向为分子微生物学E-mail:1 材料和方法1.1 材料 供试病原菌 棉花立枯病原菌-立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）由本实验室保存。培养基 马铃薯蔗糖培养基（ PDA） ，牛肉膏蛋白胨培养基（NA） ，高氏一号培养基，LB 培养基。试剂 分子生物学试剂购于宝生物工程（大连）有限公司，DNA 小量快速纯化试剂盒（3S Spin Agarose Gel
8、DNA purification kit）购于上海申能博彩生物科技有限公司。土壤样品 分别从高河周大庙，马集新庄沙地，鸡黍李固堆沙地，济宁，金乡试验田，山东农科院农田中采集棉花根际土样。1.2 拮抗细菌的筛选采用系列稀释平板分离获得 1277 个细菌分离物。采用平板对峙法筛选拮抗菌：将马铃薯蔗糖培养基倒平板，用接种锄将活化好的病原真菌切成黄豆粒般大小的块状，置于平板中央，于 28培养 23 天，待病原真菌长到直径为 2时，用接种环挑取试验菌，从靠近病原真菌的一侧沿与其生长方向相交的方向划线接种，每个培养皿接种 4 个试验菌，于28培养 2448h，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。1
9、.3 MH1 和 MH25 的鉴定形态特征、生理生化特征和 16S rDNA 序列的测定方法参阅文献6。1.4 DNA 提取和 PCR 反应DNA 的提取参考文献7。PCR 反应体系（25l）为：Taq 0.5l,10Buffer(Mg2+) 2.5l,dNTP(10mM each) 0.5l, 引物 1l, 模板 1l, depc 水 19.5l。PCR 反应条件为：95 5min, 94 1min, 56 1min, 72 1.5min 30 个循环,72 延伸 10min。用 3S 柱离心式琼脂糖 DNA 小量快速纯化试剂盒（3S Spin Agarose Gel DNA purific
10、ation kit）纯化 PCR 产物。1.5 16S rDNA 序列测定及分析PCR 产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成。测序结果用 NCBI 数据库中的 BLAST进行相似性分析，采用 DNAMAN6.0 程序进行多序列同源性分析，并用 treeconw 程序构建系统发育树。2 结果与分析2.1 拮抗细菌的筛选表 1 土样来源和分离物数目及初筛结果Table 1 sampling locations and isolates筛选批次 土样来源 分离物数目/个 获得拮抗分离物数目/个 拮抗分离物比率% 高河周大庙 125 3 2.40% 马集新庄沙地 100 4 4.00% 鸡黍李固堆沙
11、地 114 2 1.75% 济宁 108 3 2.78% 济宁 167 3 1.80% 济宁 132 2 1.52% 济宁 104 1 0.96% 金乡试验田 72 0 0.00%Comment MS1: 照片中菌体未产芽孢，需注明培养时间 金乡试验田 83 1 1.20% 金乡试验田 53 2 3.77% 济宁农科院 75 2 2.67% 济宁农科院 70 1 1.43% 济宁农科院 74 1 1.35%从 13个棉花根际土样中得到 1277个细菌分离物，初筛获得有拮抗作用的细菌分离物25个（表 1） 。从表 1看出，不同地域的 13个棉花根际土中获得的拮抗分离物的比率相差较小，这是因为取样
12、时棉花的生长期相同，决定了其根际微环境的一致性。将初筛获得的 25个有拮抗作用的细菌分离物进行复筛，结果表明 MH1和 MH25抑菌带直径可达到 30-50，经多次实验验证其抑菌效果较为稳定。2.2 MH1和 MH25的鉴定MH1的菌体大小为 0.500.551.051.10m，G +，兼性厌氧，短杆状，产芽孢且孢囊膨大，在 LB平板上培养 24h后，菌落为无色，粘稠厚重，半透明，表面湿润光滑，边缘规则。MH25的菌体大小为 0.71.02.052.10m，G +，兼性厌氧，杆状，产芽孢，在 LB平板上培养 24h后，菌落乳白色，粘稠，不透明，表面湿润有褶皱，边缘不规则。2.3 生理生化特征表
13、 3 生理生化特征Table 3 Characteristic of physiology and biochemistry 特征 characteristics MH1 B. brevisMH25 B. subtilisMH1 MH2555图 MH1和 MH25对立枯丝核菌的作用Fig 1 effect of strains MH1 and MH25 on Rhizoctonia solani KuhnMH1 MH25图 2 MH1和 MH25的光学显微镜 10100的菌体照片Fig 2 10100 light micrograph of strains MH1 and MH25Commen
14、t MS2: 具体说明，例如MH1利用阿拉伯糖产酸为阳性。不同之处逐一列出。接触酶 Peroxidase - ND + +硝酸还原 Nitrate reduction + V + +产酸： 葡萄糖 Glucose + + + +Acide production 甘露醇 Mannitol + + + +木糖 Xylose - - - +阿拉伯糖 Arabinose + - - +明胶水解 Glutin hydrolysis + + + +淀粉水解 Starch hydrolysis - - + +柠檬酸盐利用 Citrate utilization + V + +V-P反应 V-P reacti
15、on - - + +2% NaCl + V + +5% NaCl - - + +7% NaCl - ND + +10% NaCl - ND + NDpH 5.5 + - - NDpH 5.7 + ND + +pH 6.8 + ND + +pH 9.0 - - - ND生长温度 Growth at：4 - ND - -10 - ND - d15 - V + ND30 + ND + +50 + - - d65 + ND - -注：“+ ”阳性；“-”阴性；d 表示 11%89%菌株为阳性；ND 表示未测定；V 表示菌株间不稳定的反应Note: “+“positive; “-“negative；d
16、11%89%strains are positive； ND undetermination；V instabiling reaction among strains MH1和 MH25的主要生理生化特性见表 3。MH1 与 B. brevis的模式种在多数生理生化指标上具有相同的特征，少数特征如：利用阿拉伯糖产酸、pH5.5 生长、50生长等特性上不同。MH25 与 B. subtili模式种多数生理生化指标上具有相同的特征，少数特征如：利用木糖、阿拉伯糖产酸等特性表现不同。2.4 16S rDNA序列分析PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，成像如图 3所示。图 3 1% Agarose ge
17、l 电泳结果Fig 3 Electrophoresis result with 1% agarose gel 经测序分析 MH1 和 MH25 扩增的 16S rDNA 序列长分别为：1436bp 和 1445bp，将得到的序列提交 GenBank(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得注册号： EF488102，EF488103。 将 MH1 与 MH25 的 16S rDNA 在 NCBI 数据库中的 BLAST 进行相似性分析，利用treeconw 软件构建系统进化树。如图所示，看出 MH1 和短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）同处于一个最小的
18、分支，其 16S rDNA 序列与 Brevibacillus brevis B15(AY591911)的 16S rDNA 序列相似性达 99%，而 MH25 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）同处于一个最小的分支，其 16S rDNA 序列与 Bacillus subtilis YJ001（DQ44283）的 16S rDNA 序列相似性达 99%。3 讨论本试验由 13 份棉花根际土样中分离了 1277 个分离物，以棉花立枯病病原真菌立枯丝核菌（Rhizotonia solani Kuhn）为靶标菌，筛选了 25 个具有拮抗效果的分离物，其中 MH1和 MH25 拮抗效
19、果最好且拮抗性能稳定。基于 MH1 和 MH25 的表型特征，生理生化特性及 16S rDNA 序列分析，将 MH1 和MH25 分别被鉴定为 Bacillus subtilis。分离拮抗菌 MH1 和 MH25 在生理生化反应个别指标上分别与 Bacillus subtilis 的模式菌株不同，可能是菌株之间的差异或环境影响造成的。利用拮抗菌防治植物病害已被认识和广泛应用，从自然界寻找和筛选新的生防菌对生物防治具有重大意义。枯草芽孢杆菌 8进行防治棉花立枯病的盆栽试验和田间试验时，出现拮抗效果不稳定，这主要与生防菌在棉花根际定植能力、外界环境影响等因素有关。本实验从微生物生态学角度出发从棉花
20、根际筛选得到了具有较好应用潜力的 2 个拮抗菌菌种资源，更有利于其在棉花根际的定植。目前未见短短芽孢杆菌防治棉花立枯病的相关报道，为进一步探讨其生物防治机理，有关 MH和 MH25 拮抗相关基因的克隆及功能研究正在进行。利用拮抗菌防治棉花立枯病具有广阔的应用前景。References图 基于 16S rDNA 的系统发育树Fig 4 phylogenetic tree based on 16S rDNA sequenceComment MS3: 中文参考文献引用太低1Gong S J , Li G Y , Lin G C. Determination of different kinds of
21、 cotton against Rhizoctonia solani. Journal of Shihezi University(Nature Science) , 2004,22(增刊)2Tao J , Li C , Wu Y , et al. Isolation of antagonistic bacteria from tomato and Determination of inhibition effect against pathogentic fungi. Journal of Shihezi University(Nature Science) , 2006 ,24(1) :3
22、437.3Feng S L , Wang R Y , Lin K C. Identification of Bs-208 of antagonistic Bacteria and Determination of inhibition effect against several plant pathogenic fungi. Biological Chinese Journal of Control Bacteria , 2003 ,19(4) :171174.4Cao Y L , Wu Q , Liu J. Study of inhibition effect and special ch
23、aracter of secretion of Bacillus megterium B1301. Journal of Shandong Institute of Light industry. 2004 ,18(2) :51555Zhang Y P , Li G Y. Study of inhibition effect of cotton Rhizobacteria against Rhizoctonia solani. Journal of Shihezi University(Nature Science) , 1998 ,1(4) :8116Dong X Z, et al. Man
24、ual of Determination Bacteriology. Beijing: Science Press, 20017Frederick M. Ausubel et al. Short protocols in molecular biology. John Wiley & Sons , Inc , 1995.8Zhang X J , Wang Z R , et al. Biocontrol of cotton disease and infection of growth of seedling with five Bacillus. Acta Gossypil Sinica .
25、1994 ,6(1) :6164参考文献：1龚双军 ,李国英 ,蔺国仓. 不同品种棉花对立枯丝核菌抗性的测定. 石河子大学学报( 自然科学版) ,2004 ,22(增刊)2陶晶,李春,吴艳等. 加工番茄促生拮抗菌的筛选及其抑菌效果测定 . 石河子大学学报 ,2006 ,24(1) :34373冯书亮 ,王容燕 ,林开春. 拮抗细菌 Bs-208菌株鉴定及对几种植物病原菌的抑制测定. 中国生物防治 ,2003 ,19(4) :1711744曹燕鲁 ,吴琼 ,刘矫. 巨大芽孢杆菌 B1301分泌物的抑菌作用及其特性的研究. 山东轻工业学院学报 ,2004 ,18(2) :51555张亚平 ,李国英. 北疆棉花根际微生物对棉花立枯病拮抗作用的研究 . 石河子大学学报 ,1998 ,1(4) :8116东秀珠 ,蔡妙英. 常见细菌鉴定手册。北京：科学出版社，20018张学君 ,王振容等. 5株芽孢杆菌对棉花病害的防治效果及其对棉苗生长的影响 . 棉花学报 ,1994 ,6(1) :6164
