1、苛养菌及人畜共患病原菌,适用教材微生物学和微生物学检验俞树荣主编 人卫97年10月版,第十九章 小细菌 P295,内容：嗜血杆菌属、鲍特菌属大纲要求：掌握嗜血杆菌属、鲍特菌属的生物学特性及鉴定 （布鲁菌属、巴斯德菌属、弗朗西斯菌属归于人兽共患病原菌）,第一节 嗜血杆菌属(Haemophilus),嗜血杆菌属为一群无动力、无芽胞、菌体呈球杆状的革兰阴性小杆菌，生长营养需求高，培养时需人工加入新鲜血液(X因子和V因子)才能生长，故称嗜血杆菌。对人类有致病意义的种有:流感嗜血杆菌(H.influenzae)、副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)、嗜
2、沫嗜血杆菌(H.aphrophilus),一、生物学性状,形态与染色：菌体短小、两端钝圆、革兰阴性小杆菌。从病灶中新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可,呈短链。在陈旧培养物中呈多形性，有长杆状或丝状体。粘液型菌株有荚膜，有荚膜菌株多伴较强的毒力。,痰标本涂片革兰染色（流感嗜血杆菌）,培养特性:,需氧或兼性厌氧，初次分离需510%CO2才能生长良好，营养要求苛刻，在加入新鲜血液（含X因子和V因子）的巧克力培养基上经24h培养，见灰白色、圆形、光滑、半透明、直径 0.5 1mm小菌落。 部分毒性菌株(b型Hi) 可见粘液型菌落。,X因子V因子,X因子是对热稳定的物质，存在于血红蛋白中的一种血红蛋
3、白衍生物，是一种含铁的卟啉。它是细菌合成过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶的辅基，这些酶类提供细菌氧化还原时进行电子传递。V因子是对热不稳定的维生素B类物质，存在于血液和某些植物组织中。它是一种脱氢酶的辅酶，在细菌的呼吸中起递氢作用。可以根据细菌对XV因子需要的不同进行嗜血杆菌属细菌的鉴定(见P295表19-1),培养特性:,卫星现象：金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌共同培养，由于金黄色葡萄球菌能合成较多的V因子，可以促进流感嗜血杆菌的生长，故在平板上可见金黄色葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落大，而相对较远处的流感嗜血杆菌菌落较小，此现象称为“卫星现象”,卫星现象,生化反应,对流感嗜血杆
4、菌和副流感嗜血杆菌的鉴别常使用吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶等试验进行(见P296表19-2)，由于嗜血杆菌属细菌生化反应的不稳定性，现多采用半自动化鉴定。,生化反应,二、临床意义,流感嗜血杆菌：以b型有荚膜株致病为主，以儿童为主，成人较少。在引起肺炎的革兰阴性菌中本菌占第3位，仅次于铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。副流感嗜血杆菌：在某些地区致病情况与流感相似，甚至超过前者。嗜沫、副嗜沫、溶血嗜血杆菌：上呼吸道常居菌，条件致病。杜克雷嗜血杆菌：软性下疳的病原菌。,三、微生物学检查,(一)标本采集 根据病变部位采集不同标本。肺部感染患者应尽量减少上呼吸道分泌物的污染。(二)检验程序:见P297流程图,三、
5、微生物学检查,(三)检验方法1、直接镜检:多用于脑脊液和脓液标本的检验，对呼吸道标本一般不采用直接镜检方法，总体意义不大。2、分离培养：气体环境、培养基、XV因子需要、抑菌物质(每毫升巧克力琼脂内加万古霉素50ug，杆菌肽300ug，氯林可霉素1ug)、卫星现象,检验方法,X因子V因子需要试验,流感嗜血杆菌,副流感嗜血杆菌,四、预防措施,对Hib感染最有效的预防措施是肌肉注射Hib偶联菌苗。芬兰赫尔辛基于70年代后期在04岁儿童中Hib脑膜炎的发病率为43/10万。注射上述菌苗后到1991年发病率降为0。Hib的PRP可与4种蛋白载体（变异性白喉杆菌蛋白Oligosaccharide CRM1
6、97 protein, HbOC、白喉杆菌类毒素Diphtheria toxoids, D、脑膜炎双球菌外膜蛋白复合物Outer membrane protein compound, OMPC和破伤风杆菌类毒素Tetanus toxoid，T）偶联，分别构成4种类型的偶联菌苗：PRP-HbOC、PRP-D、PRP-OMPC和PRP-T。目前至少有25个国家将Hib偶联菌苗列入儿童的免疫计划。Hib偶联菌苗价格较昂贵，限制了它在发展国家内应用，因此有人报道了一种经济的接种方案，即是给婴儿接种1/2或1/3 三针全剂量的Hib偶联菌苗，借此替代常规3针全剂量免疫的接种方案。以替代方案接种后9110
7、0的婴儿仍可达到保护性抗体的浓度30.15mg/ml），与3针全剂量的接种方案所产生的结果相似。若采用替代的接种方案可减少菌苗接种的费用，以利于在发展国家中推广应用Hib偶联菌苗。,补充资料,软下疳1:该图为典型的链状排列的杜克雷嗜血杆菌，用人血液培养后取材涂片，革兰氏染色阴性，链状排列。,补充资料,软下疳3:左侧腹股沟部有一个潜行性较深溃疡，边缘不整齐，略呈蛇形，溃疡基底有脓性渗出物，溃疡周围皮肤呈现紫红色晕。另有三个豆大、一个指头大卫星状溃疡性病损。病损触之疼痛。,横痃,第三节 鲍特菌属(Bordetella),百日咳鲍特菌(B.pertussis)俗称百日咳杆菌副百日咳鲍特菌(B.par
8、apertussis)支气管败血鲍特菌(B.branchiseptica)鸟鲍特菌(B.avium),一、生物学性状（百日咳鲍特菌）,形态染色：革兰阴性小杆菌，无芽胞，有荚膜。在液体培养基中可呈短链状存在。培养：专性需氧。营养要求高，在鲍-金培(bordet-gengou)养基上需3-5天才能长出可见菌落。生化反应：见P301表19-5对抗生素的敏感性:红霉素首选,其次氨苄青霉素、阿莫西林、利福平、复方SMZ等。,二、临床意义:百日咳鲍特菌是百日咳的病原菌,1、疾病分期:卡他期：症状无特异性，与病毒性感冒类似，1-2周，此期传染性最强，采集标本阳性率最高。痉挛期：以阵发性剧烈咳嗽为主，1-4周
9、，日平均发生10-20次（类似鸡鸣），但婴幼儿的咳嗽症状可以不明显，而以合并症为主，如肺炎、出血、神经系统症状等。恢复期：阵咳减轻，完全 恢复需数周到数月。,痉咳期:咳嗽由单声咳变为阵咳，连续十余声至数十声短促的咳嗽，继而一次深长的吸气，因声门仍处收缩状态，故发出鸡鸣样吼声，以后又是一连串阵咳，如此反复，直至咳出粘稠痰液或吐出胃内容物为止。每次阵咳发作可持续数分钟，每日可达十数次至数十次，日轻夜重。阵咳时患儿往往面红耳赤，涕泪交流、面唇发绀，大小便失禁。少数病人痉咳频繁可出现眼睑浮肿、眼结膜及鼻粘膜出血，舌外伸被下门齿损伤舌系带而形成溃疡。成人及年长儿童可无典型痉咳。婴儿由于声门狭小，痉咳时可
10、发生呼吸暂停，并可因脑缺氧而抽搐，甚至死亡。此期短则12周。长者可达2月。,二、临床意义(补充),二、临床意义:,2、毒素(共有3种)百日咳毒素(PT):该菌的主要毒力因子，与阵发性剧咳等临床表现有关。丝状血细胞凝集素(FHA):促进病原体与纤毛上皮细胞粘附。腺嘌呤环酶毒素(ACT):使吞噬细胞内cAMP浓度升高从而抑制其氧化活性，使呼吸道粘膜的抵抗力下降。,三、微生物学检查,(一)标本采集： 通常在发病早期(1周内)采集鼻、咽拭子，做床边接种或立即送至实验室，采时间越迟阳性率越低，对小儿也可用咳碟法。(二)检验程序：见P302流程图,三、微生物学检查,(三)直接检查（无特异性）DFA直接荧光
11、抗体检查：可见外周黄绿色萤光，中心暗色的球杆菌，5个典型形态者为阳性。抗原检出：用单克隆抗体如ELISA法。PCR法检测核酸：目前缺乏统一的质量控制标准。,(四)分离培养,培养基：鲍-金培养基或活性炭-马血琼脂，培养3-5天可检出菌落。,(五)鉴定依据,革兰阴性小杆菌，无动力DFA法阳性普通血平板或巧克力平板不生长鲍-金培养基生长缓慢触酶阳性，氧化酶阳性,人兽共患病原菌,布鲁菌属(小细菌)鼠疫耶尔森菌(肠杆菌科)土拉热弗朗西斯菌(小细菌)鼻疽假单胞菌(假单胞菌)红斑丹毒丝菌(需氧革兰阳性杆菌)炭疽芽胞杆菌(需氧革兰阳性杆菌),第二节 布鲁菌属Brceulla P298,经DNA-DNA杂交证实
12、只有一个种，其它均为生物变种。对人类有致病的生物变种有：牛布鲁菌：流产布鲁菌羊布鲁菌：马尔他布鲁菌猪布鲁菌犬布鲁菌,一、生物学性状,形态染色：革兰阴性小球杆菌，革兰染色复染效果不好需延时至3min。培养特性：需氧，初次需5%-10%CO2。营养要求高。生化反应：触酶、氧化酶阳性(对人类有致病者),二、临床意义,该病原菌引起人类布鲁菌病，可以通过皮肤、呼吸道、消化道进入人体感染。感染人群多与动物性食品、毛皮加工或食用未消毒的牛奶感染。患者主要为菌血症表现：发热(波浪热)和其它全身症状。,第五节 弗朗西斯菌属Francisella P304,该属只有一个种：土拉热弗朗西斯菌，引起人类土拉热。病原菌
13、常由野兔携带，又称野兔热杆菌。可因直接接触而感染，也可因动物咬伤、蚊虫叮咬、食入污染食物、吸入等途径感染。感染后表现为发热、剧烈头痛、关节痛，甚至发生衰竭和休克，表现与伤寒类似。局部感染时可出现溃疡，局部淋巴结肿大、坏死等。,第三节 红斑丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae P262,本菌为红红斑丹毒丝菌病的病原菌。急性传染，多发于家畜，人也可因接触而引起皮肤软组织感染，称类丹毒。生物学性状：革兰阳性杆菌，厌氧或微需氧，触酶氧化酶均阴性。临床意义：多发生于屠宰工人和鱼、肉加工人员或兽医。类丹毒为一种传染性皮炎，常始于伤口，局部形成病灶，皮肤红肿有水疱，局部淋巴结肿大
14、，可伴有关节炎或全身症状。因可以产生蔓延性水肿，民间俗称“流火”。,丹毒,左侧大腿内侧鲜红一片，境界清楚，稍高出皮表，压之皮色变白，放手即红。大腿根部起紫色水泡，水泡破溃，基底色赤，痛如火燎，伴恶寒发热，腿根部有肿大臖核。,丹毒,耳郭局部潮红，边缘清晰，与正常皮肤界限分明，皮肤表面有光泽并稍隆起。,第二节 炭疽芽胞杆菌Bacillus anthracis P256,炭疽芽胞杆菌简称炭疽杆菌，引起人或动物炭疽病。宿主广泛，传播方式多样，芽胞抵抗力很强，病死率很高。9.11事件后曾在美国部分地区引起大恐慌。,(一)生物学性状,本菌为致病性细菌中最大的革兰阳性杆菌。菌体两端平齐，培养后呈竹节状排列。
15、芽胞多在有氧条件下形成，产毒株有明显的荚膜。需氧或兼性厌氧，普通培养基上形成灰、粗糙型菌落，边缘不整、卷发状。液体培养基中由于形成长链而呈絮状生长，在明胶培养基中可使表面液化呈漏斗状，在深部由于沿穿刺线扩散生长成倒松树状。,在普通琼脂平板培养24小时,长成直径24mm的粗糙菌落。菌落呈毛玻璃状，边缘不整齐，呈卷发状，有一个或数个小尾突起，这是本菌向外伸延繁殖所致 。,炭疽芽胞杆菌,炭疽芽孢杆菌的芽胞：芽胞细胞质（SMp），芽胞类核（SN），芽胞细胞膜（SM），芽胞细胞壁（SW），芽胞皮层（SCt），外芽胞膜（OSM），和芽胞壳（SC） 超薄切片，81 000,炭疽芽胞杆菌,炭疽芽孢杆菌的芽孢：
16、，发芽中的芽孢，芽胞壳（）已崩解；发芽的芽胞，芽胞壳和胞子囊（）均已崩解；，芽孢已释放，仅存芽胞囊碎片（）超薄切片，28 000,炭疽芽胞杆菌,炭疽是炭疽杆菌所致人和畜类都可发生的急性传染病，可分皮肤炭疽，肺炭疽和肠炭疽三型。诊断要点：皮肤炭疽通常发生于面，颈，手和前臂等露出部位的皮肤，往往单发。组织显著肿胀及浸润，由于组织出血坏死，在病灶的中心区可形成明显凹陷的黑色干痂。局部淋巴结肿大且常化脓。病人常有发热，呕吐，头痛，关节痛及全身不适等症状。大部分病例经1-2周后黑痂脱落而成溃疡，愈合成疤。少数严重病例。局部呈大片水肿及坏死。伴有高热和严重的全身中毒症状，可致死亡。,炭疽芽胞杆菌,炭疽芽胞
17、杆菌菌落表面的细胞呈曲线排列（）金属镀膜，1 500,5、抗原结构,荚膜多肽抗原，能抑制调理作用，与细菌的侵袭力有关，也能抗吞噬; 由D谷氨酸多肽组成，抗原性单一，若以高效价抗荚膜血清与具荚膜炭疽杆菌作用，在其周边外发生抗体的特异性沉淀反应，镜下可见荚膜肿胀。菌体多糖抗原， 由等分子量的乙酰基葡萄糖胺和D半乳糖组成，能耐热，与毒力无关。这种抗原没有特异性，能与其他需氧芽胞杆菌，肺炎球菌14型及人类A血型物质发生交叉反应。芽胞抗原，芽胞抗原有免疫原性及血清学诊断价值。保护性抗原，为一种蛋白质，是炭疽毒素的组成部分，具有很强的免疫原性；,6、毒素,炭疽杆菌繁殖体能分泌炭疽毒素，此毒素由第因子（水肿
18、因子，EF）、第因子（保护性抗原，PA）及第因子（致死因子，LF）所组成的复合多聚体。3种成分混合注入动物体内就出现炭疽病典型中毒症状。具有抗吞噬作用与免疫原性。,7、抵抗力,繁殖体 562小时、751分钟 可被杀灭。繁殖体 常用浓度的消毒剂也能迅速杀灭。芽 胞 抵抗力极强，在自然条件或在腌渍的肉中能长期生存。在土壤中可存活数十年，在皮毛制品中可生存90年。芽 胞 经直接日光曝晒100小时、煮沸40分钟、140热3小时、110高压蒸气60分钟、以及浸泡于10%福尔马林液15分钟、新配石炭酸溶液（5%）和20%漂白粉溶液数日以上，才能将芽胞杀灭。炭疽芽胞对碘特别敏感，对青霉素、先锋霉素、链霉素、
19、卡那霉素等高度敏感。,微生物学检查,标本采集：采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，吸入性炭疽的咯痰，肠炭疽的粪便以及病人的的血液等送检，兽尸禁止解剖，可割取耳朵或舌尖一片送检；检材明显污染者可先加热6530分钟以消灭杂菌。,检验程序：见P258流程图 (1)涂片检查取水疱内容物、病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液及脑脊液等作涂片，先加11000升汞固定，以破坏芽胞，染色后可发现有荚膜的典型竹节状大杆菌。荧光抗体荚膜染色找到链状大杆菌周围有发荧光的荚膜者为阳性。(2)分离培养检材应分别接种于血琼脂平板、普通琼脂平板、碳酸氢钠平板。血标本应事先增菌培养。如液体量很少，可先于肉汤内增菌4小时后接种
20、于平板。如见可疑菌落，则根据生物学特征及动物试验进行鉴定。,微生物学检查,微生物学检查,(3)Ascoli试验：由于炭疽芽胞杆菌的菌体多糖抗原能耐热、耐腐败，在病兽腐败脏器或毛皮中虽经长时间煮沸仍可与相应免疫血清发生沉淀反应，称为Ascoli热沉淀反应。由于炭疽杆菌沉淀原由于耐高热性，在尸体组织或皮毛中数年仍能检出，该试验可用作追溯性诊断。,1噬菌体裂解试验 将一接种环3746h待检菌肉汤培养物，涂布于普通营养琼脂平板，干后将AP631炭疽噬菌体滴于平板中央或划一直线，干后置3718h，出现噬菌斑或噬菌带者为阳性。2串珠试验 将待检菌接种于含0.050.5IU/ml青霉素的培养基经37培养6h
21、后，炭疽杆菌可发生形态变化，形成大而均匀成串的圆球状菌体，类炭疽杆菌无此现象。3青霉素G抑制试验 将待检菌接种于含5、10、100IU/ml青霉素的普通营养琼脂平板上，37培养24h，炭疽芽胞杆菌一般在5 IU/ml的青霉素平板上仍能生长，在含10、100 IU/ml青霉素的平板上生长受到抑制而不生长。,微生物学检查,4串珠和青霉素G抑制联合试验 将待检菌新鲜肉汤培养物0.1ml滴于预温的兔血琼脂平板上，用L型棒涂抹均匀，干后用含青霉素1IU/片纸片贴于平板，37培养12h，打开平皿在低倍镜下观察，可见纸片周围有一无菌生长的抑菌环，其外周由于青霉素浓度低，菌体细胞壁受损而形成串珠。平板继续37孵育812h，测量其抑菌环直径。5碳酸氢钠毒力试验 将待检菌接种于含0.5%NaHCO3和10%马血清的琼脂平板上，置10%CO2环境培养2448h，有毒株形成荚膜，菌落呈粘液型，无毒株不形成荚膜，呈粗糙型菌落。,微生物学检查,6动物接种取患者的分泌物、组织液或所获得的纯培养物接种于小白鼠或豚鼠等动物的皮下组织，如注射局部处于24h出现典型水肿、出血者为阳性反应，动物大多于3648小时内死亡，在动物内脏和血液中有大量具有荚膜的炭疽杆菌存在。分离出的可疑炭疽杆菌应用鉴定试验。7植物凝集素试验 自学。,微生物学检查,
