第七章口腔生物学实验教程.ppt

1、第七章 口腔生物学实验教程,提要：口腔生物学实验教程是针对口腔生物学理论课设计的实验指导内容。其教学目的是让学生通过实验，掌握基本的口腔生物学研究技术和方法，加深对理论课所学知识的理解，培养学生对口腔医学基础研究的兴趣，了解基本的科研设计思路，启发学生的科研思维。,内容目录,第一节 口腔微生物学实验 实验一 菌斑的采集、染色和观察、分类 实验二 变异链球菌的分离和鉴定 实验三 细菌代谢酸的测定 实验四 细菌细胞外葡聚糖的测定 实验五 菌斑中pH值的测定 第二节 口腔生物化学实验 实验六 龈沟液中碱性磷酸酶活性的测定 实验七 唾液钙和磷含量的测定 实验八 唾液分泌情况的测定,第三节 口腔疾病分子

2、生物学 实验九 以釉原蛋白基因进行性别鉴定第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 实验十 成骨细胞的分离培养 实验十一 成骨细胞的分离培养 实验十二 MTT法检测细胞活性 实验十三 肿瘤细胞迁移实验（细胞划痕法）,内容目录,第一节 口腔微生物学实验,实验一 菌斑的采集、染色和观察、分类,实验目的与要求: 掌握牙菌斑标本的采集、处理和常用染色刚果红（congo red）负性染色的主要程序和方法，熟悉龈上或龈下菌斑中常见细菌的形态及分类方法。实验内容: 菌斑标本的采集；细菌涂片的制备、染色；染色细菌的观察及 Listgarten分类。实验设备和器材等用品： 香柏油，二甲苯，菌斑染色剂，酒精，浓盐酸和灭

3、菌的液状石蜡等。无菌牙科镊子、挖匙或探针（龈上菌斑检查用），载玻片，灭菌取菌环可卸式取菌器或消毒滤纸（龈下菌斑采集用），含预还原转送培养基的带盖小瓶，普通光学显微镜，试镜纸，细菌接种环及装有固体培养基的培养皿等。,第一节 口腔微生物学实验,实验方法：,菌斑采集和处理,染色,观察,分类,第一节 口腔微生物学实验,龈沟内采集法 牙周袋内采集法,龈沟或牙周袋的龈下菌斑采集法,第一节 口腔微生物学实验,刚果红负性染色方法：,Listgarten的分类标准：,球菌：菌细胞直径0.5m1.0m，包括少量球杆菌；直杆菌：菌细胞宽0.5m1.5m，长1.0m1.9m，包括部分分支杆菌；丝状菌：菌细胞宽0.5m

4、1.5m，长与宽之比大于61，菌细胞多为不规则的长丝状杆菌；梭状菌：菌细胞直径0.3m1.0m，长约10m，其末端呈梭状；弯曲杆菌：菌细胞呈新月形或弯曲状；螺旋体：菌细胞宽0.2m0.5m，长约10m20m，螺旋形，包括大、中、小三种螺旋体。,第一节 口腔微生物学实验,实验结果与分析：,注意事项： 1.染色操作中，用浓盐酸熏蒸涂片时要小心。 2.该法不能检测细菌的活动性，但染色涂片可长期保存。思考题： 刚果红负性染色有何优点？菌斑采集时应该注意什么？,龈上菌斑涂片刚果红负性染色结果,第一节 口腔微生物学实验,实验二 变异链球菌的分离和鉴定,实验目的和要求： 通过对菌落特点和菌细胞形态及革兰染色

5、特征的观察，初步掌握菌斑标本中变异链球菌的分离、培养和表型鉴定的主要程序和方法，熟悉牙菌斑中常见细菌的菌落特点、菌细胞形态及革兰染色特点。 实验原理： 变异链球菌能发酵蔗糖等多种碳水化合物，而其他口腔链球菌不发酵山梨醇和甘露醇；根据其菌落形态、染色特点及耐氧情况，以其特殊的生化反应可以分离和鉴定变异链球菌。实验内容：,第二节 口腔生物化学实验,主要实验设备和器材、试剂等：厌氧培养装置如简易厌氧袋、厌氧罐、厌氧培养箱或厌氧手套箱均可；普通孵箱，旋涡混合器，微量振荡器，和普通光学显微镜。可调式移液器、加样头，小试管，三角形推棒，接种环、酒精灯，载玻片，无菌棉签，96孔反应板，EP管；口腔检查用口镜

6、，镊子，检查盘，无菌纱球，无菌探针和龈上锄形洁治器。革兰染色试剂，系列生化基质和指示剂（包括甘露醇、山梨醇、菊糖、精氨酸试剂、七叶苷水解试剂）。变异链球菌ATCC25175悬液。MS琼脂、BHI琼脂培养基、巯基乙醇酸盐转送液，0.2mol/L、pH 7.0 的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)等。,第一节 口腔微生物学实验,实验方法：变异链球菌群细菌的分离和表型鉴定,菌斑标本,接种到MS或TS琼脂上,微氧孵育（37、5%10% CO2 48小时）或厌氧孵育（3748小时、90%N2+ 10%CO2或 80%N2+10%CO2+10%H2）,菌落、菌细胞形态检查,生化鉴定,确定菌种,次代培养纯化、富集,

7、分散、稀释,置转送液中运送,第一节 口腔微生物学实验,革兰染色步骤：,细菌涂片加热固定,加革兰（碱性结晶紫）甲液、乙液各一滴，混匀后初染30秒,革兰碘液媒染30秒,丙酮-乙醇混合脱色剂脱色510秒,石炭酸复红复染5秒,干燥后1000倍显微镜油镜下观察,水洗,水洗,水洗,水洗,第一节 口腔微生物学实验,表型鉴定（1）菌落特征观察,初代培养的菌落观察要点： 形态：如水滴状、圆形、丝状、不规则状、根状、梭形等。 大小：菌落直径一般以mm计，注意大小的一致性。 厚薄：扁平、丘状、凸、半球状、瘤状(中央凸)。 颜色：无色、白、黄、红、绿、黑或棕色。 边缘：如整齐、锯齿状、波状等。 透明度：透明、半透明、

8、不透明。 菌落型：光滑、粗糙、黏液样。 溶血型：、（限血平板）。,实验结果及结果评价,在5%10%CO2、90%95%的N2，或80% N2、10%CO2和10%H2的大气环境下37孵育48小时,第一节 口腔微生物学实验,表型鉴定（2）菌细胞形态和染色特征观察,菌细胞形态：球形、杆形、球杆形、弯曲状、梭状、菌细胞末端形状、细胞内有无颗粒、肿胀等。革兰染色特征：阳性、阴性染色,染色均匀性。,实验结果及结果评价,第一节 口腔微生物学实验,生化鉴定：,革兰染色鉴定次代培养为纯培养后，收集琼脂表面的菌苔，用PBS稀释成2109/ml菌量,取待测的细菌悬液100l，加入10个反应板微孔中,分别加入100

9、 l不同的生化基质，各加2孔,同时加PBS为阴性对照，加变异链球菌ATCC25175为阳性对照,振摇混合30秒后，37 孵育4小时-24小时,取出反应板，加入指示剂，观察记录结果,实验结果及结果评价,第一节 口腔微生物学实验,生化鉴定反应板微量快速生化实验名称、试剂及结果：,第一节 口腔微生物学实验,反应板微量快速生化实验：利用细菌产生的预成酶（胞外酶），在37普通孵箱中与生化试剂基质产生特异的酶反应，通过各种指示剂或特殊的显色产物即可在4小时24小时观察到结果。反应板微量快速生化实验的生化鉴定系统包括30个生化实验基质与相关指示剂、磷酸盐缓冲液（PBS）、细菌标准浊度管以及8个鉴定系列,可根

10、据细菌的形态、染色性及耐氧实验结果选择不同的系列生化基质进行鉴定。这8个鉴定系列是： 革兰阳性厌氧球菌 革兰阴性厌氧球菌 革兰阳性无芽胞厌氧杆菌 革兰阴性无芽胞厌氧杆菌：a.不产黑色素的革兰阴性厌氧短杆菌； b.产黑色素的革兰阴性厌氧短杆菌；c.革兰阴性厌氧梭状或长杆菌 革兰阴性弯曲菌 梭菌属 变异链球菌和其他口腔链球菌 微需氧的革兰阴性厌氧杆菌,第一节 口腔微生物学实验,菌种鉴定变异链球菌群细菌的鉴别：,第一节 口腔微生物学实验,实验注意事项：,要设阳性和阴性对照。细菌浓度对实验结果的影响 浓度低可导致假阴性结果，最佳的细菌浓度为 2.11010/ml2.41010/ml,如菌浓度略低可适当

11、延长酶反应时间。酶反应时间与菌种的关系 酶反应时间因不同菌种有所差异，以4小时24 小时为宜。待测标本放置时间 以新鲜的放置24小时48小时培养物为宜。如标本不能 立即做生化实验，可将其放置在4冰箱内，时间最好不超过96小时。预成酶微量生化实验所用细菌应来自不加血的非选择培养基，以避免产生 假阳性结果。,实验报告： 变异链球菌的分离与鉴定。思考题： 变异链球菌的菌细胞形态特征、菌落特征、耐氧特征和生化反应特征主要有哪些？,第一节 口腔微生物学实验,实验三 细菌代谢酸的测定,实验目的与要求： 学习用色谱技术定性和定量检测分析细菌代谢脂肪酸的基本方法。实验原理： 各种脂肪酸在色谱柱（固定相）及流动

12、相中的分配系数、吸附能力不同，导致它们在柱中的保留时间有所差异。同种酸停留时间相同；峰面积与含量正相关。 实验内容： 1.液体纯培养增菌。 2.色谱层析技术测定细菌培养液中短链脂肪酸的种类及相对含量。实验主要设备、器材等： 色谱仪，细菌培养箱，离心机，PH计，三角烧瓶，接种环，移液 器，微量注射器和EP管等。,第一节 口腔微生物学实验,实验方法：,样品制备：,色谱层析：,第一节 口腔微生物学实验,实验结果分析： 结果计算： 培养液中各组分保留时间与标准酸图谱比较定性，按下式计算： C有机酸 =,注意事项：实验前要用流动相平衡分析柱；注意温度对分析结果有影响。,实验报告与评定：细菌代谢酸测定。思

13、考题： 色谱层析实验中哪些方面非常重要？ 细菌代谢酸的测定除了采用色谱层析技术以外，还可以用哪些方法测定？,Area有机酸,Area标准C标准,第一节 口腔微生物学实验,实验四 细菌细胞外葡聚糖的测定,实验目的与要求： 变异链球菌可以产生葡糖基转移酶，综合蔗糖产生细胞外多糖即水溶性或不溶水葡聚糖。通过实验要掌握用比色法测定葡聚糖含量的方法和原理。实验原理： 糖在强酸溶液中加热，脱水生成羟醛，再变成呋喃衍生物。此衍生 物可以与各种试剂反应生成有色物质，然后用分光光度计测得密度值，进而计算出糖的含量。以蒽酮法为例,其可与单糖、双糖、糊精和淀粉反应生成有色 化合物，在一定的浓度范围内，测得的葡聚糖含

14、量与光密度值成正比。实验内容： 蒽酮法测定变异链球菌培养液中细胞外葡聚糖的含量。,第一节 口腔微生物学实验,实验主要设备和器材：蒽酮试剂 称取200mg蒽酮溶解于100ml浓硫酸中搅拌溶解。4冰箱可保存23周。葡聚糖标准储存液 称取1.0g葡聚糖，溶于100ml水中制成储存液。使用时吸取1.0ml稀释至100ml，储存于4冰箱中。分光光度计，离心机，10ml试管，恒温水浴箱，水浴锅及吸管，移液器，氢氧化钠等。,第一节 口腔微生物学实验,实验方法：,样品处理：将水溶性和非水溶性多糖分开测定，即：,测定：将水溶性和非水溶性多糖分开测定，即：,1. 标准曲线 按下表配制标准液。搅拌3分钟后放入95水

15、浴中加热6分钟，冷却，用分光光度计测量波长625nm的光密度值，绘制标准曲线。,2. 样品测定 取样品1.0ml(质量浓度在20g/L40g/L为宜)，加蒽酮试剂3ml，95水浴煮沸6分钟，冷却后测其625nm处的OD值，根据标准曲线及稀释倍数计算样品中葡聚糖的含量。,注意事项： 配置标准液时应在15水浴中加入蒽酮。实验报告评定： 细菌细胞外葡聚糖的测定。 思考题： 细菌细胞外多糖有几种？如何分别检测这些细菌细胞外多糖？,第一节 口腔微生物学实验,实验五 菌斑中pH值的测定,实验目的与要求： 菌斑pH的测定可分为两大类，即活体测定与离体测定。 电极接触法(touch pH electrode

16、method) 活体测定 埋藏电极遥测法(intraoral or indwelling pH electrode systems) 离体测定：如人工菌斑法,实验内容： 1. 电极接触法 是活体菌斑pH检测法，即将手持的微电极置于原位的菌斑表面来测定菌斑的pH。 2. 埋藏电极遥测法 是体内检测方法。 3. 人工菌斑法 人工菌斑法是先建立人工菌斑模型，然后用未刺激和刺激的唾液同菌斑作用，同时电极测定pH变化。实验主要设备和器材： 微电极，吸液用注射器，pH计，隔湿用消毒棉球等。,第一节 口腔微生物学实验,1. 电极接触法 是活体菌斑pH检测法，即手持微电极测定菌斑pH的方法。（1）用注射器吸取

17、1ml标准pH溶液，滴入电极敏感端部位，校正pH计。（2）受试者2天不漱口刷牙，测试前2小时不进食。（3）用棉卷隔湿并用气枪吹干测试部位。（4）测定“静态”pH：手持微电极置于原位的菌斑表面，待离子计数稳定时记录pH值。每一时间点测试受试者同一颗牙的上下左右4个位点，取其平均值即为菌斑原位pH值，且4个位点在1分钟内完成测试。（5）测定动态pH：受试者可先测定静态PH值；再让受试者进食不同的食物，在一定的时间间隔中测定动态pH；也可分别测定龋齿敏感部及邻牙界面的PH。（6）测试操作： 测定时，将微型玻璃电极或锑电极直接插入要测的牙菌斑中； 参比电极通过饱和氯化钾盐桥与受检者身体相连，多放在前臂

18、或口底； pH计也可连接自动描绘装置，将测到的pH直接绘制成图。,第一节 口腔微生物学实验,2.埋藏电极遥测法 是菌斑pH的体内检测方法。（1）用注射器吸取1ml标准pH溶液滴入电极敏感端部，校正pH计。（2）将一个微型玻璃电极埋入离体的釉质小块中。（3）用棉卷隔湿并用气枪吹干测试区域。（4）将埋入釉质小块中的微型玻璃电极放入局部义齿中，戴入受检者口腔内缺牙的部位，让电极的敏感面向着基牙的邻面和咬合面。也可在电极的后方接一个微型的场效应晶体管，以增加传导速度，提高敏感性，减少干扰。（5）参比电极的接法一般与接触法相同，或者也埋入义齿中，以细导线与口外连接。（6）根据实验要求观察菌斑在电极头的聚

19、集和pH变化情况。（7）电极敏感端的菌斑可以确定为类似于邻面或窝沟部位的牙菌斑。,第一节 口腔微生物学实验,3. 人工菌斑法 是先建立人工菌斑模型，然后用未刺激和刺激的 唾液同菌斑作用，同时用电极测定pH变化。在整个测试过程中，人工唾液均处于流动状态，且流速可变。,实验报告评定： 菌斑中pH值的测定。思考题： 三种测试pH的方法各有何优缺点？,注意事项： 菌斑中pH值受多方面因素的影响，如口腔环境、唾液、饮食的 酸碱度以及口腔清洁情况等，因此测定时要做好隔湿防护。,第一节 口腔微生物学实验,第二节 口腔生物化学实验,实验目的与要求： 牙周炎处龈沟液中该酶的活性变化与牙周袋探诊深度和炎症程度明显

20、正相关，与牙周炎破坏和牙周组织状况相关。通过实习要求掌握龈沟液中ALP的基本检测方法。 实验原理：ELISA法定量测定ALP,实验内容： 1.龈沟液样品采集与制备； 2.ELISA法测定ALP的染色操作； 3.酶标仪测定吸光度值，确定ALP的相对含量。,实验六 龈沟液中碱性磷酸酶活性的测定,第二节 口腔生物化学实验,龈沟液采集,洗提,ELISA法检测ALP,酶标仪测定OD450nm值,实验方法：,主要实验设备和器材：,第二节 口腔生物化学实验,注意事项：龈沟液的量少，易受多种因素影响，采集时动作要轻柔，排除全身影响因素（如生理周期、性激素等）和局部刺激因素，并注意防止污染。每次实验留一孔作为空

21、白调零孔(不同于空白孔)，测量时先用此孔调OD值至零。严格按规定的时间和温度进行孵育。所有试剂必须在用前恢复至室温；用后应立即冷藏。洗板很重要，在加入检测溶液B或底物前要尽量吸干孔内液体，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。实验时酶标板加盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板长时间处于干燥状态。,第二节 口腔生物化学实验,注意事项：操作时要带手套，板底勿残留的液体和手指印，否则影响OD值的准确性。在储存和孵育时要避免强光直接照射，底物避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。未用完的酶标板或试剂务必于28保存，避免不准确稀释而造成的浓度误差；检测液及底物溶液要在用前配制，且应

22、37温育30分钟。加样或加试剂时，应注意减少时间间隔，以保证准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟以内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。,第二节 口腔生物化学实验,实验结果及分析： 根据龈沟液中ALP含量检测的OD值结果、空白对照等，分析实验结果。思考题： 哪些因素能影响龈沟液中碱性磷酸酶的含量测定？,第二节 口腔生物化学实验,实验七（1）唾液钙含量的测定,目的和要求：了解分光光度法的定量原理，熟悉减少实验误差、提高准确度的方法和操作技术，掌握利用市售试剂盒测定唾液中钙浓度的原理和方法。,实验原理：,实

23、验主要用品和设备：,第二节 口腔生物化学实验,实验方法：1. 唾液收集及处理 收集非刺激性唾液约0.5ml，3000r/min离心10min，取上清液备测。2. 分光光度计测定 准备三组EP管，按下表顺序分别加入试剂： 3.各管在振荡器上混匀，以空白管校正零点，在分光光度计上测定612nm波长下的OD值，按下式计算含量： 样品中钙的浓度（mmol/L)=样品管光密度/标准管光密度2.5,第二节 口腔生物化学实验,思考题： 试分析误差产生的原因？含量计算的方法有哪些？,注意事项：为保证测试结果的可靠性，所有实验器皿一定要清洗干净且用三蒸水多次冲洗、烤干后待用。也可在试剂中加入少量的 EDTA 作

24、掩蔽剂，消除实验器皿和试剂中的钙污染，在试剂中加入8-羟基喹咛以去除镁的干扰。为避免玻璃中的钙离子溶出，钙标准贮存液用塑料瓶保存。为提高分析结果的准确度，减少偶然误差，应增加平行测定次数。本实验所测结果为唾液中总钙浓度。,第二节 口腔生物化学实验,实验七（2） 唾液中磷含量测定,目的和要求：了解分光光度法的定量原理，熟悉减少实验误差、提高准确度的方法和操作技术，掌握比色法测定唾液中磷含量的原理和方法。,实验原理：,实验内容： 1.收集口腔唾液； 2.测定唾液中总钙含量。实验设备和用品：,硫酸,还原,第二节 口腔生物化学实验,实验方法和步骤：,1. 标本收集及处理 收集非刺激性唾液0.5ml，取

25、0.2ml，加10%三氯 醋酸3.8ml，充分混匀，放置10min，3000r/min离心10min，取上清液备测。2. 测定 准备三组EP管，按表7-4顺序分别加入试剂：,3. 结果计算 C唾液（mg/ml）=A样品/A标准C标准=A样品/A标准0.005(mg/ml),第二节 口腔生物化学实验,注意事项：为了保证测试结果的可靠性，所有实验器皿一定要清洗干净 且用三蒸水多次冲洗，烤干后待用。为了避免玻璃中的磷离子溶出，磷标准贮存液用塑料瓶保存。为了提高分析结果的准确度，减少偶然误差，应增加平行测定次数。本实验所测结果为唾液中总磷浓度。,思考题： 1. 唾液中磷含量测定误差的种类有哪些？ 2.

26、 含量计算的方法有哪些？,第二节 口腔生物化学实验,实验八 唾液分泌情况的测定,实验目的与要求： 唾液分泌量及成分的测定对一些疾病诊治效果的评估有重要意义。通过实习要求掌握静态流率和静态流率的测量意义和方法，掌握单个腺体分泌测定的方法，为将来临床研究奠定基础。实验内容： 1. 静态唾液总流率的测定； 2. 动态唾液总流率的测定； 3. 单个腺体唾液分泌的测定。材料、用品及设备： 消毒的带漏斗试管和普通试管，无菌棉球或棉垫，天平，色层分析纸，Lashley杯，0.1mol/L枸橼酸(或1g胶姆，或方糖等)。,第二节 口腔生物化学实验,实验方法：1. 静态唾液总流率测定 常用测定方法包括：吸取法(

27、draining)：手持带漏斗的试管，使唾液沿下唇逐渐流入试管，至结束时，受试者将口内剩余唾液全部吐入试管。通常收取15分钟，计算单位时间的唾液量。吐取法(spitting)：使唾液在口底聚集，受试者每隔60秒将其吐入试管，一般收集10分钟，低于1ml/10min为异常减低。吸引法(suction)：用负压吸引器将唾液自口底持续吸入试管，吸引头置于舌下。棉垫法(swab)：将每个约0.24cm0.6cm的棉垫预先称重，置于口内各唾液腺导管开口处，收集后称重。吐取法及吸取法相对常用，操作简便，还可用于动态唾液总流率的测定。而吸引法和棉垫法会产生一定刺激，操作相对复杂，目前多不使用。,第二节 口腔

28、生物化学实验,实验方法：2. 动态唾液总流率测定 常用测定方法包括：酸刺激法：将0.1mol/L枸橼酸滴于舌背前部，每次4滴，受试者将舌尖后卷，分泌唾液用吐取法收集一般测5分钟10分钟。咀嚼刺激法：将1g胶姆以每分钟20次的频率咀嚼10分钟,低于10ml/10min为异常低下；或用5g医用白蜡，温水泡软后咀嚼6分钟，低于6ml/6min为异常低下。方糖法：取方糖1.5cm1.5cm置于舌背上，勿动，正常情况下15分钟30分钟方糖全部溶化，否则认为分泌功能低下。酸刺激法可能影响唾液的缓冲容量和pH等。,第二节 口腔生物化学实验,实验方法：3. 动态唾液总流率测定 包括腮腺、下颌下腺与舌下腺的测定

29、。常用测定方法包括：腮腺唾液分泌测定：用Lashley杯吸附于颊黏膜的导管开口处，静止腮腺流率变异较大，而酸刺激流率低于1ml/5min为异常低下。下颌下腺与舌下腺唾液分泌测定：因两腺体常共同开口于口腔，所以测定分泌时常收集在一起，常用插管法和隔离法。小唾液腺唾液分泌测定：通常用色层分析纸收集，擦干局部黏膜后贴于黏膜2分钟后，用湿度仪测其含水率。,第二节 口腔生物化学实验,实验报告与评定：静态唾液总流率或动态唾液总流率，或单个腺体分泌情况分析。思考题： 静态唾液流率测定和动态唾液流率测定应该注意些什么？各应用于何种情况下？,注意事项：使用咀嚼法测定唾液腺分泌时不影响唾液成分，相对比较常用，但要

30、注意保持恒定的咀嚼频率。单个腺体唾液收集方法较复杂，且不能反映所有唾液腺总的分泌状况，在评价整个唾液腺功能时有局限性，不过在测定唾液成分时因污染少而多采用此方法。,第二节 口腔生物化学实验,第三节 口腔疾病分子生物学,实验九 以釉原蛋白基因进行性别鉴定,实验目的与要求： 通过此实验学会PCR检测技术，包括DNA提取、分光光度计的使用、引 物设计的原则、PCR扩增的条件设定，以及电泳和测序结果分析等。实验原理： 针对Amelogenin基因内含子1区x染色体上6bp缺失的特性，采用一对x、 Y同源引物扩增，男性个体同时得到x染色体Amelogenin等位基因特异 性段(简称Am X，106 bp

31、或212 bp)和Y染色体Amelogenin等位基因特异 性片段(简称Am Y，112bp或218 bp)，分型结果表现出两条谱带；而女 性仅有Am X(106 bp或212 bp)，分型表现为一条谱带，因此鉴定性别。实验内容：,第三节 口腔疾病分子生物学,实验设备及器材：,5ml无菌试管（含肝素抗凝剂）；PowerPlex M16 system DNA提取试剂盒，Am 基因上游引物和下游引物，2Taq PCR MasterMix；20bp DNA Ladder Marker；DNA片段快速纯化试剂盒。,实验方法：,样品采集,采集静脉血5ml于无菌抗凝管中,DNA 提取和含量检测,性别鉴定,

32、PCR 扩增、凝胶电泳、纯化测序,第三节 口腔疾病分子生物学,实验方法：,DNA 提取和含量检测：,第三节 口腔疾病分子生物学,实验方法：,性别鉴定PCR 扩增、凝胶电泳、纯化测序PCR 扩增：PCR反应引物序列如下：上游引物( 5- CCCTGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG-3)，下游引物( 5-ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG3)；模板DNA为上述血液所获样品的DNA提取液。PCR 反应体系为25L，其中2Taq PCRMasterMix 12.5l，上下游引物( 1mol /L)各1l，无菌双蒸水9.5l，模板DNA 1l。PCR 反应参

33、数: 95预变性5分钟；95变性30秒，60退火30秒，72延伸30秒，35个循环；72延伸7分钟。凝胶电泳：制备浓度为3g/L的琼脂糖凝胶，置1TAE电泳缓冲液中，电泳条件为: 电压100V，电泳时间120分钟。电泳结果放入凝胶成像仪中进行观察。纯化测序：将琼脂糖凝胶上的特异性条带切下纯化、回收、测序。,第三节 口腔疾病分子生物学,结果分析：,M-marker；1、2-阴性对照；3、5-女性；4-男性,实验报告评定： PCR扩增后凝胶电泳和测序结果分析评定。思考题： 1.PCR检测分析技术中最重要的关键环节有哪些？ 2.PCR实验中容易出问题的操作有哪些？应该如何避免？,第三节 口腔疾病分子

34、生物学,注意事项：引物 引物是PCR反应的关键，其特异性取决于引物与模板DNA的互补程度。引物的长度最好为15bp30bp；引物扩增跨度以200bp500bp为宜，特定条件下可扩增长度至10kb的片段；其中G+C含量以40%60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物内部出现二级结构或两条引物间互补，特别是3端的互补；3端的碱基，尤其最末及倒数第二个碱基应严格要求配对；引物中有或最好加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点；引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；每条引物的浓度0.1mol1mol或10pmol100pmol，以最低引

35、物量产生所需要的结果为好。PCR 循环次数 循环次数决定PCR扩增的程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30次40次之间，循环次数越多，但非特异性产物的量亦随之增多。设立对照 PCR反应应设立阳性对照和阴性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要参考指标。,第三节 口腔疾病分子生物学,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验十 成骨细胞的分离培养,实验目的与要求： 掌握分离、培养和鉴定成骨细胞方法，了解成骨细胞的功能与特性。实验原理： 成骨细胞一个明显特征是可形成矿化结节，故采用Von Kossa染色法对成骨细胞形成的矿化结节进行

36、鉴定。实验内容： 成骨细胞的收集、培养和鉴定。实验主要设备与器材：,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验方法： 采用酶消化法无菌下分离获取幼兔成额、顶骨分离成骨细胞体外培养成骨细胞观察、鉴定成骨细胞：形态、钙化能力测定。,1. 成骨细胞的收集,出生十天内的大耳白兔清洗、75%酒精浸泡消毒5分钟剪开皮肤后环行剪下颅骨(顶骨及额骨)用含500U/ml青霉素、500 g/ml 链霉素的无菌PBS液冲洗三次用剪刀和镊子剔除结缔组织和血管剪碎成1mm3大小用0.25%胰蛋白酶37C预消化20分钟加含0.2%的型胶原酶和0.1%的透明质酸酶消化（共消化5次，每次在37C恒温震荡20分钟） 取第3、4、

37、5次消化的细胞悬液300g离心10分钟弃上清沉淀的细胞用不含血清的-MEM培养基洗涤离心用含10%胎牛血清的-MEM培养液重悬吹打均匀后以1105/ml密度接种到培养皿置于37C 、5%CO2培养,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,2. 成骨细胞的培养（1）24 小时后可见细胞贴壁生长，更换新鲜含10%胎牛血清的-MEM培养液。以后每隔48小时换液一次。（2）待细胞长满至70%80%，用0.25%胰蛋白酶消化，使贴壁细胞消化松解、变圆后吸出消化液，加入含10%胎牛血清的-MEM培养液终止消化。（3）轻轻吹打细胞，待其脱壁后调至相应的细胞密度，移入培养瓶中进行培养后的继续实验。3. 成骨细胞的

38、鉴定（1）用倒置相差显微镜观察成骨细胞形态及生长情况。 （2）茜素红（Alizarin Red）染色观察矿化结节（3）改良Gomori钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,结果分析：倒置显微镜下观察：成骨细胞从球形、悬浮状到梭形、三角形或多角形梭形或鳞片状，有较多突起逐渐可见基质堆积、结节、钙化结节形成。矿化结节观察：茜素红染成橘红色颗粒状。ALP染色成骨细胞胞浆呈黑色。,钙化结节茜素红染色不同时间的变化,思考题：除茜素红染色法外，还有什么方法可以鉴定获得的细胞属于成骨细胞？成骨细胞的功能与破骨细胞有关吗？如何提高成骨细胞分离培养的成功率？,注意事项:2%硝酸钙、

39、2%硝酸钴和1%硫化铵要用前新鲜配制。,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验十一 破骨细胞的分离培养,实验目的与要求： 破骨细胞是高度分化的多核巨细胞，是骨组织吸收时的功能细胞。通过本实验，要求学会从幼年动物骨内分离和培养和观察破骨细胞的基本技术，了解鉴定破骨细胞的主要方法。实验原理： 已知机体的破骨细胞来源于单核-吞噬系统的骨髓干细胞，所以可以从机体年轻骨髓中分离获得该细胞。实验内容： 1. 从年幼的动物的长管骨或颅盖骨分离破骨细胞； 2. 培养和观察破骨细胞； 3. 破骨细胞的鉴定。,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验方法：1. 分离破骨细胞取新出生的白兔5只用肥皂水洗涤三次清水

40、冲净断头处死浸泡于75%乙醇中1分钟去皮分离股骨、肱骨、胫骨和颅盖骨置盛有60ml Hanks液的培养皿 刮除软组织及软骨骺置Hanks液洗2次移入12ml含有抗生素的199培养液纵行剖开骨以手术刀轻刮骨的内表面用尖吸管反复吸取培养液冲洗骨髓腔内表面至色发白为止静置1分钟，取悬液备用。,主要实验设备与器材：,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,2. 骨片制备将放至-70C冰箱中储存的牛股骨取出，在冲水降温的条件下分切成6mm 6mm0.2mm大小的骨片，并用不同粗细的砂纸磨成10m厚。将骨片置生理盐水中于超声波清洗器上处理5分钟3次。将超声处理后的骨片浸入含抗生素的199培养液中浸泡5分钟10

41、分钟3 次。3. 破骨细胞培养 取24孔板，孔内分别放入骨片和盖玻片，并分别加入1ml199培养液，置5%CO2培养箱中恒温预热1小时。每孔加入0.5ml上述制备的细胞悬液，培养15小时20小时后，吸去悬液，用199培养液冲洗未贴壁的细胞，继续培养并观察骨片被吸收的情况，根据细胞生长、骨片吸收情况和实验需要，决定培养终止时间。4. 破骨细胞鉴定 用倒置相差显微镜或电镜观察；酸性磷酸酶或降钙素染色后鉴定。,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,4. 破骨细胞鉴定 （1）倒置相差显微镜观察培养破骨细胞的形态； （2）HE染色：生长有细胞的盖玻片分别于3天7天取出，80%乙醇固定，HE染色，脱水，二甲

42、苯透明，树胶封片，光镜观察； （3）甲苯胺兰染色：将细胞盖玻片置甲醇中固定10分钟，1%甲苯胺兰染色3分钟，95%乙醇分色、蒸馏水冲净，空气干燥后二甲苯透明、树胶封片，光镜观察； （4）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色进行破骨细胞鉴定：将细胞爬片置37温箱中5分钟干燥后，置2.5%的戊二醛中4固定10分钟，然后用孵育液温育至37，双蒸水洗3次，苏木素复染2分钟，自来水冲洗反蓝，晾干、二甲苯透明、树胶封固，光镜观察。,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,（5）破骨细胞骨吸收活动的观察：甲苯胺兰染色：培养的第7天取出培养板中的骨片，2.5%戊二醛固定7分钟，于0.25mmol/L氢氧化铵中超声清

43、洗5分钟3次，系列酒精脱水，自然晾干，含1%硼酸钠的1%甲苯胺蓝染色3分钟，自然晾干后光学显微镜下观察。用扫描电镜观察破骨细胞在骨磨片上形成的骨吸收陷窝：经破骨细胞培养至10天的骨片以0.25 mol/L氢氧化铵超声处理10 分钟，清除骨片上的破骨细胞，再以2.5%戊二醛固定、1%锇酸固定、酒精系列脱水、 醋酸异戊酯置换酒精后，二氧化碳临界点干燥、喷金后扫描电镜观察。,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,倒置相差显微镜可见骨片上破骨细胞吸收陷窝,破骨细胞TRAP染色胞浆呈红色,结果分析与实验报告评定：破骨细胞的分离培养与鉴定,注意事项:破骨细胞在体外具有形成骨吸收陷窝的功能，但是由于其是终末分

44、化细胞，不能分裂，故其分离、培养一般只能存活10天以内；可以观察破骨细胞与骨片共培养后1天10天内的不同时间的变化。由于破骨细胞的生活习性是贴壁生长，所以分离破骨细胞时，要使用胰蛋白酶进行消化，去除周边的成纤维细胞，只留下贴壁的破骨细胞，才能使破骨细胞得以充分伸展和移动，也才能使其功能研究便于观察。,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验目的与要求： 通过本实验学习要求掌握用MTT法测定细胞增殖活性的基本方法，学会使用酶标仪检测吸光度，应用生物软件或Excel绘制实验结果图，并了解解析结果的意义。实验原理： 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒（forma

45、zan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪测定其在波长490nm处的吸收光值，可间接反映活细胞数量。在一定数量范围内，100U/ml MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。实验内容： MTT法测定不同浓度药物如尼古丁对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响； 用酶标仪检测吸光度值； 应用生物软件或Excel绘制实验结果图，解析结果的意义。,实验十二 MTT法检测细胞活性,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验主要设备和器材：,实验方法：,第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养,实验方法：将培养至对数生长期的口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113稀释成2.5104个 /ml后，接种于96孔板，每孔200l，置5%CO2、37C恒温培养24小时至细胞贴壁。吸弃培养液，加入不同浓度梯度的尼古丁（0M、0.01M、0.1M、1M），每个浓度设置3个复孔，以0M 者为阴性对照，置5%CO2、 37C恒温培养24小时后，每孔加入5mg/mlMTT试剂20l，继续培养4小时。轻轻吸弃培养液，每孔加入DMSO 150l，锡纸包裹孔板15分钟后，用酶标仪进行比色，读取并记录波长490nm下的每孔OD值。按照下式计算细胞生长抑制率，根据实验结果绘制细胞生长抑制曲线或柱形图，分析实验结果。 （对照-空白）-（给药-空白）/（对照-空白）100%=细胞生长抑制率,