1、 分类号： R393 密 级： 公开 U D C： 610 编 号：201310027攻 读 硕 士 学 位 研 究 生 毕 业 论 文儿童扁桃体组织 IL-4、MMP-9mRNA 的表达及意义论 文 起 止 时 间 ： 2012.062013.03指 导 教 师 ： 杨 英 教 授 学 生 姓 名 ： 万 贝 贝 论 文 类 型: 应用基 础 研 究 学 科 专 业 名 称： 耳鼻咽喉学 研 究 方 向 ： 耳鼻咽喉基础与临床 学 院 ( 系 、 部 )： 医 学 院 青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 2 页 共 33 页目 录中文摘要（3）英文摘要（4）前言（6）材
2、料与方法（9）结果（12）讨论（15）结论（18）参考文献（19）附录（22）致谢（24）综述（25）攻读学位期间取得的研究成果（30）学位论文独创性声青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 3 页 共 33 页明（31）学位论文知识产权权属声明（32）中文摘要儿童扁桃体组织中 IL-4、MMP-9 mRNA 的表达及意义目 的 探讨白细胞介素 -4（lnterleukin4） 、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9）在儿童炎性扁桃体组织、生理性肥大扁桃体组织表达程度的差异性，进一步探讨两者在儿童慢性扁桃体炎病程中的临床意义。方 法 选取青
3、海大学附属医院的住院患儿，其中 45 例为慢性扁桃体炎观察组，40 例为扁桃体生理性肥大对照组。观察组，男性 22 例，年龄 4-12 岁，对照组，男性 19 例，年龄 3-10 岁。采用 RT-PCR 方法检测收集样本中的 IL-4、MMP-9mRNA 基因的表达情况，应用统计软件把所得数据进行相应统计学的分析。结 果 IL-4、MMP-9 在慢性扁桃体炎组织及扁桃体生理性肥大组中均有表达，IL-4 在炎性扁桃体组织中的表达水平的半定量测值为（ 1.0940.264 ）明显高于其对照组（ 0.6340.148） ，MMP-9 在炎性扁桃体组织中的表达水平的半定量测值为（ 0.8510.239
4、）明显高于其对照组（ 0.5470.122） （p0.05） 。青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 4 页 共 33 页结 论 与儿童生理性肥大扁桃体组织比较 IL-4、MMP-9 mRNA 表达水平在炎性扁桃体组织中表达水平有显著提增，IL-4、MMP-9 可能在慢性扁桃体炎病程改变中发挥着重要作用。提示干预 IL-4、MMP-9 可能是治疗慢性扁桃体炎的一种可行思路。关 键 词 白细胞介素-4；基质金属蛋白酶-9；慢性扁桃体炎论文类型 AAbstractExpression And Significance Of IL-4、MMP-9mRNA In Children
5、TonsilWanBeibeiObjective To investigate the difference expression of lnterleukin4（IL-4）and matrixmetalloproeinase-9（MMP-9）gene intissue of the chronic tonsillitis group and normal tonsil group，and then do relative analysis and to investigate its clinical significance in the patients.Methods Collecti
6、ng 45case of chronic tonsillitis and 40 case of normal tonsil as control group in Affiliated Hospital Of Qing Hai University, and the chronic tonsillitis group,the male 22, aged from 4 to 12, the control group, 19 cases of male, aged from 3 to 10 years old. RT-PCR was used to detect the expression o
7、f samples of IL-4, 青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 5 页 共 33 页MMP-9mRNA gene , application of statistical software to analysis the corresponding statistical data.Result IL-4 and MMP-9 were all expressed in the tissue of chronic tonsillitis and tonsillar physiological hypertrophy group , semi-quantitativ
8、e expression level of IL-4 in inflammatory tonsillar tissue in the measurement was (1.094 0.264) and significantly higher than that of the control group (0.634 0.148), semi-quantitative expression level of MMP-9 in inflammatory tonsil tissues measurements as (0.851 0.239) was significantly higher th
9、an that of the control group (0.547 0.122) (p0.05).Conclusion Compared with childrens physiological hypertrophy tonsil tissue ,the expression in inflammatory tonsil tissue of IL-4 and MMP-9 were increased significantly, which may play an important role in changing the course of chronic tonsillitis.P
10、rompt intervention IL-4, MMP-9 may be is an effective way of treating chronic tonsillitis.Key Words IL-4; MMP-9; chronic tonsillitisThesis type A青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 6 页 共 33 页前 言慢性扁桃体炎是耳鼻咽喉头颈外科最常见的疾病之一，其具有导致肾脏、心脏及关节等多处免疫损伤的潜在危害。其病理分型为3型：增生型、纤维型、隐窝型。它的临床特点是反复发作的扁桃体感染，目前认为其发病为多种因素共同作用的结果，至今国内
11、外对于慢性扁桃体炎的确切发病机制尚不清楚，而机体免疫功能紊乱在其发生发展中占有重要地位 1。无炎症情况下，扁桃体组织内无IgE +细胞，一旦出现人们推测有变态反应的发生。近年来有研究表明，扁桃体的反复炎症会造成组织中出现较多的IgE +B淋巴细胞，研究推测变态反应在扁桃体炎的发病过程中有可能起着非常重要的作用 2。研究表明Th1/Th2平衡的紊乱是慢性扁桃体炎反复感染的主要因素之一。T淋巴细胞及其亚群在机体识别外来抗原，促使机体产生相应细胞因子并且参与细胞免疫应答过程中起着非常重要的作用，CD4 +在调节机体免疫系统中的作用非常重要，它通过自身分泌的细胞因子对免疫系统中不同细胞生物学活性起着相
12、应调节作用，对何时启动机体免疫反应、何时终止反应以及反应的强弱调节起青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 7 页 共 33 页着关键性作用 3。CD4 +细胞根据自身细胞因子分泌模式的差异将分为Th1和Th2两大不同功能的亚群，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-r等Th1类因子，主要参与由细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞免疫，有效的Th1类细胞反应在清除机体外来病原微生物的刺激过程中有着非常重要的作用。Th2细胞以分泌IL-4、IL-5等细胞因子为主，主要参与机体体液免疫环节的调控 4。当机体未受外来病原刺激的情况Th1/Th2处于平衡调节状态，若Th1/Th2失衡就将引发机
13、体免疫功能的紊乱，结合其他外在因素可导致机体发生免疫性疾病 5。在有关Th1/Th2平衡紊乱的研究中多以Th1类炎性因子的主要代表IFN-，Th2类的主要代表为IL-4 6。机体Th1/Th2的紊乱可导致出现大量外来病源微生物的入侵感染及自身免疫性疾病的发生、肿瘤细胞的逃逸免疫以及移植手术后排斥反应的发生。有研究结果表明慢性扁桃体炎患儿外周血T细胞免疫功能紊乱，Th1类细胞因子产生水平不足，功能低下，而Th2细胞功能状态的报道尚不多见 7。有研究证实在变态反应性疾病的病程中有着非常重要作用的是Th2类细胞因子分泌的IL-4。它在Tho细胞分化为Th2细胞过程中担当着相当大的调节控制作用，使得淋
14、巴细胞以及嗜酸性粒细胞的游走功能大大增强 8，是机体病理免疫改变反应发生的中心。人IL-4、IL-5主要有激活CD4 +T细胞产生IgE的能力，它在IgE的合成分泌释放中起着主要调节功能，目前理论已证实变态反应的核心介质是IgE，因此对于IL-4的分泌调控治疗有可能成为抑制变态反应发生的强有力方法9-10。炎性扁桃体组织细胞中分泌的IL-4是通过介导T细胞上的IL-4R受体从而进一步引发Th细胞的信号转导途径，启动机体Th2样病理性免疫反应的发生，从而引发扁桃体组织中的变态反应。金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPS)是主要参与降解机体各种组织细胞外基质的蛋白
15、酶类家族,包括弹性蛋白酶以及整合于细胞外基质中的各类胶原酶等,它们的活性需要Zn 2+、Ca 2+等金属离子来激活。基质金属蛋白酶-9(marix metallproteinases, MMP-9)作为此酶类家族中的主要代表,具有超强的降解细胞外基质和基底膜的功能。目前研究表明，基质金属蛋白酶与许多免疫系统疾病有着密切的联系。其中研究的最热点集中在基质金属蛋白酶9在类风湿关节炎中的表达。而国外的最新研究也表明基质金属蛋白酶参与扁桃体组织降解细胞外基质的病理生理过程。特别是基质金属蛋白酶9与扁桃体细胞外基质青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 8 页 共 33 页炎症变化有着
16、密切联系。研究表明基质金属蛋白酶家族中，基质金属蛋白酶9可以精确的调节T细胞的活化。随着基质金属蛋白酶的表达被抑制，细胞外基质特异性t细胞反应也随之下调 11。慢性扁桃体炎作为耳鼻咽喉头颈外科最常见的疾病之一，它的起病原因目前暂无明确定论。近年来国内外学者对慢性扁桃体炎的发病机制进行了许多方面的研究。最新的研究显示，在慢性扁桃体炎的发病过程中细胞因子有着不可或缺的作用。人们在不断的研究中发现许多新的与此病有着密不可分联系的细胞因子。IL-4作为Th2类细胞代表因子，参与扁桃体的免疫反应。其二者的关系已经得到国内外学者的实验论证，但MMP-9作为近几年出现的一类新的细胞因子，其在扁桃体组织中的表
17、达研究甚少。由于它特有的具有降解基底膜和细胞外基质的生物学功能，使得它在免疫反应中的作用越来越受到重视。IL-4与MMP-9都参与免疫病理过程。所以研究二者在扁桃体组织中的表达对深入探讨慢性扁桃体炎的起病原因及治疗手段有重大的意义，可以为防治儿童慢性扁桃体炎提供新的研究依据。本实验采用RT-PCR方法检测慢性扁桃体炎患儿及扁桃体生理性肥大的OSAHS患儿的扁桃体组织中IL-4和MMP-9的表达，探讨二者在儿童慢性扁桃体炎的发病机制中所起的作用。青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第 9 页 共 33 页材料和方法1.临床资料选取2012年39月在青海大学附属医院耳鼻喉科住院行
18、扁桃体摘除术的45例扁桃体炎患儿的扁桃体组织作研究对象（观察组），年龄412岁，男性20例。根据2007年儿童阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）诊疗指南草案（乌鲁木齐）标准诊断 12，同期取40例因单纯增生肥大的OSAHS患儿的扁桃体组织作为对照组其中，年龄310岁，男性21例。2.实验方法2.1 标本取材与保存术中取扁桃体组织，用无菌去酶蒸馏水冲洗，每份扁桃体组织用高温灭菌的手术刀片切割成小组织块，用灭菌无酶的锡纸迅速将组织包裹，暂时保存在液氮保温杯中，之后快速将保温杯中组织放进实验室-80冰箱中冻存。2.2 实验试剂与来源青海大学医学院 2010 级攻读硕士学位研究生毕业论文第
19、10 页 共 33 页试剂名称 来源提取RNA试剂 Invitrogen 逆转录试剂盒 Invitrogen GoTapGreen mastermix TIANGEN 引物合成 Invitrogen 2.3 引物设计方法用IL-4、MMP-9、内参因子-actin mRNA序列作为模板，应用引物设计软件合成引物完整序列。将完整序列交由生物制剂公司合成。IL-4 F：5-CAGTTCTACAGCCACCATGAGA -3,R:5-CATGATCGTCTTTAGCCTTTCC -3；扩增片段长度为201bp；MMP-9 F:5-CGCAGACATGGTCATCCAGT-3，R:5- GCATTGG
20、CCTTGGAAGATCA- 3；扩增片段长度为406bp；-actin F:5- TGGGACGACATGGAGAAAA -3 ，R:5- CAGGAAGGAAGGCTGGAAG -3,扩增片段长度为567bp。 2.4 组织RNA的提取冰盒中迅速称取之前冻存备用的扁桃体组织80100mg，在超净工作台上用Trizol试剂提取扁桃体组织的RNA。用移液器取1mL Trizol试剂加入已放置称取的扁桃体组织的匀浆器中快速进行冰上匀浆。匀浆之后将组织液体转移至1.5mL的EP管中室温放置5min，后放置离心机中进行4，12000g离心10min，待离心完毕取上层液转至另一EP管中，按体积比计算，
21、加入1/5体积的氯仿，用力颠倒混匀后室温静置23min,之后进行4，12000g离心15min，吸取上层无色水相，加入等体积的异丙醇提纯RNA，混匀后室温静置20min，再次4，12000g离心10min，弃上清液，管底可见RNA沉淀。沉淀中加入1mL预冷的75%乙醇（DEPC水配）洗脱，弃上清，放置室温干燥。提取的RNA用2050L DEPC水溶解，质检RNA的浓度和纯度，通过质检的RNA将用来进行后续实验或放置-80冰箱冻存。2.5 逆转录的合成取质检合格的RNA 5L，分别加入dNTP和oligo(dT)各1L，取3L DEPC水调配总体积至10L，颠倒混匀后放入65的温箱中，5min后迅速置于冰盒中
