1、第九节分子直接进化技术,生物的自然进化,进化过程： 突变自然选择遗传后代进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的-多个基因或同一个基因（同源性） 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（如木糖 木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性,分子进化工程的种类,获取新基因的方法,常规的基因工程方法 已知的生物、基因和功能新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题,基因直接进化的用途,改变酶的特性-多功能或单功能酶提高酶活性
2、-天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍改变底物特异性和对映异构体选择性-酯酶可水解非天然酯类改变酶的工艺性-冷适应和热适应酶改善酶的稳定性-二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶获取许多新的理论知识,TLPs 的失活曲线,TLP-ste突变蛋白的三维结构,酶拓扑结构的变化,蛋白质的耐热机制,天然耐热蛋白质特性： 减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比；除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去-支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不超过75%。分子进化耐热蛋白质特性： 邻-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变体8g8的了稳定
3、性提高了17C，但突变的氨基酸数仅有13个，与天然酯酶同源性高达97%。,基因直接进化的步骤,突变 基因突变库的建立筛选 基因突变库的活体或离体筛选基因复制与遗传,建立基因突变库的方法,PCR方法 1）易错PCR法 2）随机引物延伸法DNA重组装（DNA Shuffling)方法 1）外显子、单基因和基因家族的重组装 2）随机多重组PCR法(RM-PCR)随机片段活体突变法 线状基因和随机片段共转化酵母细胞,易错PCR方法,Random-priming recombination(RPR),随机引物重组法,随机挑取枯草杆菌蛋白酶RPR库中10个克隆序列,DNA重组装原理图(DNA shuffl
4、ing),1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性；4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段,随机挑取枯草杆菌蛋白酶DNA重组装库中10个克隆序列,Table 1 Frequency of active clones obtained after DNA shuffling under different conditions,a As suggested in ref. 7.b Clones exhibiting 10% wild-type subtilisin E activity.,DNA重组装过程,多重组和随机多重组PCR原理图,RM-PCR法构建随机重组装库(A)和剪接库(B),基因突变库的筛选方法,活体筛选法 遗传互补筛选法活体-离体筛选法 噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）离体筛选法 1）核糖体显示技术 2）RNA-蛋白质融合技术(RNA显示技术）,丝状噬菌体的生活周期,噬菌体显示筛选模式,噬菌体显示的几种类型,M13噬菌体pIII和pVIII的显示,核糖体显示技术,RNA-蛋白质融合技术,RNA-蛋白质的融合,寡霉素与核苷酸的连接,Myc ds-DNA的富集,谢谢大家！,交错延伸PCR突变法,质粒肽库的设计和筛选,（引自Schatz等，1996）,抗体库的构建和筛选,
