1、 项 目 编 号云南省教育厅科学研究基金项目 申 请 书自 然 科 学 基 础 应 用 研 究 基 金 项 目 人 文 、社 会 科 学 研 究 基 金 项 目 2 类 别 : 科 技 开 发 ，科 技 成 果 推 广 和 科 技 兴 农 基 金 项 目 3 青 年 教 师 科 研 基 金 项 目 4项 目 名 称：灯盏花乙素抗缺血性脑损伤作用的分子机制研究院 校：昆明医学院 系、 所、 室：云南省天然药物药理重点实验室 项 目 负 责 人 姓 名 ： 雷 伟 亚电 话：0871-5316883申 请 日 期：2004.3.1云 南 省 教 育 厅 制1填报说明一、填写申请书前，请先查云南省教
2、育厅科研经费管理办法及科学研究基金项目检查、评价实施办法。申请项目必须符合基金资助范围。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹清楚易辩。二、申请书为十六开本，复印时用 A4 复印纸，于左侧装订成册。从第 4 页至 12 页各栏空格不够时，请自行加页。封面上“项目编号”申请者不必填写。三、部分栏目填写要求：类别在相应的基金类别后的“ ”中划“” 。项目名称应确切反映研究内容，最多不超过 25 个 汉字。项目性质根据研究内容填写“基础研究” 、 “应用研究” 、 “开发研究”或“人文社科研究” 。所属学科及代码填写申请项目所属的最低层次学科及代码。 （以中华人民共和国国家
3、标准规定的学科分类与代码为准）项目组主要成员指每年参加研究工作五个月以上，在项目组内起主要作用的人员，不包含申请者，最多录 10名。四、经费预算表（表二）中，其他经费来源一栏，指所申请的基金项目在其他渠道申请并获资助的请填明资助金额，申请过但未获准的项目请打“” ，没有申请过的项目请填“” 。五、项目申请书须经学校签署具体意见，加盖公章后一式三份报送云南省教委厅科技处。2一、基 金 申 请 简 表项目名称 灯 盏 花 乙 素 抗 缺 血 性 脑 损 伤 作 用 的 分 子 机 制 研 究名 称 药理学项 目性 质 应用研究所 属学 科 代 码 310.4710研究项目 起止年月 自 2004
4、年 10 月至 2006 年 10 月 申请金额 3 . 0 万元姓 名 雷伟亚 性 别 男 年 龄 53技术职称 药理工程师 学 位 专 业 药理学学 校 昆明医学院 系、所、室 省天然药物药理重点实验室申请者 详细地址 昆明市人民西路 191 号 电话 5316883总人数 高级 中级 初级 学士 硕士生 博士生 博士 后 参加单位数学位情况6 2 1 3建 立 脑 I / R 损 伤 模 型 ， 应 用 免 疫 组 织 化学 、 分 子 生 物 学 等 技 术 和 方 法 ， 研 究 灯 盏 花 乙素 抗 缺 血 性 脑 损 伤 的 作 用 分 子 机 制 ， 为 临 床 防治 缺 血
5、性 脑 血 管 疾 患 寻 找 抗 损 伤 药 物 作 用 靶 点和 为 我 省 中 药 灯 盏 花 药 用 资 源 的 开 发 和 利 用 提主要研究内容和意义摘要（ 限120字 ） 供 实 验 和 理 论 依 据 ， 具 有 重 要 实 用 价 值 。阐 明 O N O O - - P A R P 通 路 在 脑 I /R 损 伤 中 的 地 位 和 作 用 ； 阐 明 灯 盏 花 乙 素 抗 脑I / R 损 伤 作 用 的 分 子 机 制 ， 为 临 床 防 治 缺 血性 脑 血 管 疾 患 寻 找 药 物 作 用 靶 点 和 我 省 灯 盏 花预期目标及成果（ 限100字 ） 乙 素
6、 迈 向 国 际 市 场 提 供 科 学 实 验 和 理 论 依 据 。3二、申 请 项 目 经 费 预 算 表其 中 其他经费来源 （万元）申请资助金额2004 年 2005 年 200 年 200 年 200 年国 家 自 然基 金 项 目国 家 其 他资 助 项 目省 内 资助 项 目自 筹经 费3 万元 3预算支出科目 金 额（ 万 元 ） 开 支 说 明仪器设备费0.5 各项指标的检测费实验材料费 2.11放射性同位素试剂、荧光指示剂、分子生物学试剂、免疫组织化学试剂等科研业务费 0.3动物费、水电费、文献检索费、论文发表费、会议费及 Intrenet 费等其他费 0.09 科研管理
7、费填表说明： 1.仪器设备费：指资助项目专用的简易仪器设备的购置和运杂等费，自制设备的材料及加工费。2.实验材料费：指科研用消耗性材料、试剂、药品等购置费，标本、样品采集加工和运杂费。3.科研业务费：包括动力设备和燃料试验所需的动力、燃料费，实验用动、 植物购置、养殖费，计算机上网费、测试、分析费（使用本单位设备应不收或只收消耗费） ，本项目必需的调查研究、学术会议、业务资料等费。4.其他 ：管理费不超过资助金额的 3，由单位统一掌握。未签4订协议的协作费以及资助项目批准前已发生的支出，不得列入。三、研 究 项 目 组 成 员 登 记 表姓名 性别年龄专业技术职 务（职称）专业 工作单位在本项
8、目中的分工每年用于本项目工作的月数签章 学历雷伟亚 男 53 工程师 药理 昆明医学院 主持、主要完成者 6王殿华 男 51 教 授 病生 昆明医学院 项目指导 6 博士杨为民 女 34 副教授 药理 昆明医学院 主 要完成者 6 博士张恒丽 女 27 在 读研究生 病生 昆明医学院 主 要完成者 6 学士褚薇薇 女 28 在 读研究生 病生 昆明医学院 主 要完成者 6 学士谢利霞 女 27 在 读研究生 病生 昆明医学院 主 要完成者 6学士5四、 研究项目的意义、内容、目标和解决问题的方法 等6一、 本研究项目的科学依据和意义（包括科学意义和应用前景，国内外研究概况、水平和发展趋势，学术
9、思想，立论根据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处）研究意义近年来，随着溶栓方法、动脉搭桥术、心脏外科体外循环、断肢再移植和器官移植方法的建立和应用，缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion，I/R）损伤仍然是造成患者死亡的重要原因。因此，对 I/R 发病机制的研究受到国内外界医学的高度重视。大量研究表明活性氧（Reactive oxygen species，ROS ）在 I/R 损伤发病机制中起重要作用。然而，新近研究报导 NO 和 O2 反应产生的过氧亚硝酸阴离子（peroxynitrite，ONOO -）介导聚 ADP 核糖基聚合酶（Poly- （ADP-ribose）p
10、olymerase，PARP ）活化作用可能是心肌等器官再灌注、炎症和休克等病理过程中造成组织细胞功能障碍和细胞死亡一条新的重要通路（ONOO PARP Pathway） 1。目前，这一通路已成为国内外学者研究许多疾病病理发生机制的新热点。缺血性脑损伤是多种神经系统疾病（缺血性脑病、脑梗塞等）的病理学基础，近年来，对其发病机制进行了多方面的探讨，PARP 作为 DNA 损伤的重要组成部分，在缺血性脑损伤中的作用机制研究得到广泛关注。研究报道，灯盏花素在临床上治疗缺血性脑损伤疾患等，总有效率均达到 90%以上，其作用明显优于复方丹参、维脑路通等对照组。然而其确切的药物作用靶点和分子水平作用机制不
11、清，因此研究 ONOO PARP 新通路在脑 I/R 损伤中的地位和作用，探讨灯盏花乙素抗脑 I/R 损伤中的作用分子机制，不仅为临床防治缺血性脑血管疾病后所造成脑损伤作用寻找抗 I/R 损伤药物作用的靶点提供实验和理论依据，也为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用奠定科学实验和理论依据，创造巨大的社会和经济效益，因而具有重要实用价值。国内外研究现状PARP 是广泛存在于真核细胞内的核酶，具有多种生物学作用 2。在生理情况下，主要参与 DNA 修复和维持基因的稳定性，在转录水平上调节多种蛋白质的表达（iNOS、NF- B 等） ，调节端粒酶的活性，清除组织严重受损的细胞等多种功能 3。大量文献报
12、道氧化应激引发 PARP 过度活化导致 NAD 和 ATP 减少，引起组织细胞功能障碍和细胞死亡（凋亡和坏死） ，在中风、心肌缺血、糖尿病及其引起的心血管功能障碍、休克、创伤性的中枢神经系统损伤、炎症等病理过程中起重要作用 4。新近研究证实 PARP 过度活化可激活 NF-B ，引起细胞因子、化学趋化因子、粘附分子等炎症介质基因表达增加 5。一些研究报导心肌、肠、肾、眼及骨骼肌 I/R 损伤中，ON00 -介导 PARP 活化引起细胞损伤和细胞死亡，而应用 PARP 抑制剂 3-aminobenzamide 可以阻止细胞损伤和细胞死亡，提示 ONOO PARP 通路在 I/R 损伤中的作用 6
13、。DNA 单链断裂被认为是诱发 PARP 活化作用的7重要因素 7。目前认为自由基氧化物特别是 ONOO 是 DNA 单链断裂的强烈作用剂8。 Beckman 等（ 1990 年）首先发现 ONOO 具有生物学作用 2最新生物化学研究证明ONOO 为 NO 与 O2 的反应产物，是一种强烈的氧化剂，具有强烈的细胞毒性作用 9。因而，ONOO 在器官 I/R 损伤、内毒素性休克、炎症和动脉粥样硬化等病理过程中的作用已成为目前国外医学界研究的新热点 10。有研究表明，脑缺血后，NMDA 受体兴奋，Ca 2+内流，从而激活 NOS，引起 NO 释放，NO 与 O2-反应生成 ONOO-。此外，炎症反
14、应，缺血再灌注及多种细胞损伤机制作用于细胞后都能产生 ONOO-11。ONOO -通过攻击 DNA 分子中的氢原子，打开核糖的糖环，使得 DNA 断裂，从而激活PARP。Ischiropoulos 等（1992 年）发现 ONOO 可使蛋白质酪氨酸残基硝基化生成代谢物硝基酪氨酸（Nitrotyrosine，NT ）而氧自由基、NO 2-、NO 及其氧化还原形式则无此作用 12。目前已公认 NT 是 ONOO-在体内生成的特异性标志物。应用免疫组织化学、分子生物学等技术检测组织细胞内有 NT 存在可直接证明 ONOO-的作用 13、4 。灯盏花（灯盏细辛）为菊科短葶飞篷属科植物（Erigron
15、brelis-capus(vaniot) Hand Mazz） ，产地云南，其提取物含多种黄酮类活性成分 15。已证实黄酮类化合物有抗氧化作用，灯盏花素可能是通过直接清除自由基，抑制脂质过氧化 16。研究表明，灯盏花素注射液可明显增加脑缺血及再灌注后 ATP 含量，减轻脑 I/R 损伤 17。另外发现，灯盏花素能显著降低降低豚鼠气道上皮细胞 NF-B 的表达水平。据报道，灯盏花素在临床上治疗缺血性脑损伤等脑血管疾患，总有效率均达到 90%以上，其作用明显优于复方丹参、维脑路通等对照组。然而，其确切的药物作用靶点和分子作用机制不清。新近研究发现，灯盏花主要有效成分为灯盏乙素（Scutellari
16、n） ，其结构式为：4,5,6三羟基黄酮7葡萄糖醛酸甙 18。目前对灯盏乙素药理学作用的研究开展不多，其作用机制更是少见报道，因此研究其作用及机制对灯盏花系列资源的可持续发展利用具有重要的理论和实用价值。本课题拟在脑 I/R 损伤模型，应用免疫组织化学、 Western Blot、荧光显微镜等技术和方法，研究 ONOO PARP 通路在缺血性脑 I/R 损伤中的地位和作用，以及探讨灯盏花乙素抗脑 I/R 损伤中的作用分子机制，不仅为临床防治缺血性脑血管疾患后所造成脑损伤作用寻找抗 I/R 损伤药物作用的靶点提供实验和理论依据，也为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用奠定科学实验和理论依据，创造巨
17、大的社会和经济效益，因而具有重要实用价值。主要参考文献1. Szabo C. Schock.1998;9:341-3442. Beckman JS. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:16203. De Murcia G, Schreiber V, Molinete M, et al. Mol Cell Biochem. 1994;138:15-244. Virag L, Szabo C.Pharmacol Rev.2002;54:375-4295. Oliver FJ,Menisser de Murcia J,Nacci C, et al. Eur Mol Bi
18、ol Organ.1999;18:4446-445486. Zingarelli B,Cuzzocrea S,Zsengeller Z, et al. Cardiovasc Res.1997;36:205-2157. Mohnete M, Vermeulen W, Burkle A, et al. Eur Mol Biol Organ. 1993;12:2109-21178. Szabo C, Ohshima H. Nitric Oxide. 1997;1:878-8859. Ronson RS, Nakamura M, Vinten-Johansen J. Cardiovasc Res. 1
19、999;44:47-5910. Richard BR.Life Scie. 1997;60:183311. Szabo C. Free Radio Biol Med.1996;21:855-86912. Ischiropoulos H. Arch Biochem Biophys. 1998;356:1-1113. Kamisaki Y, Wada K, Bian K. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:11584-1158914. Souza JM, Daikhin E, Yudkoff M, et al. Arch Biochem Biophys. 1999;3
20、71:169-1715. 张人伟，张元玲，王杰生等. 中草药. 1988；19（5）：716. 淤泽溶. 中国民间民族医药杂志. 1996；22：2417. 陈小夏，何冰，杜淇璋. 中药新药与临床药理. 1998；9（4） ；214-21618. 张卫东等，灯盏细辛化学成分的研究，中国药学杂志，2000，35(8)：514-516二、 研究内容和预期成果（说明研究项目的具体内容并明确重点解决的科学问题，预期成9果和提供的形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及其科学意义；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用前景）研 究 内 容1. 建立脑 I/R 损伤模型，观测脑组织髓过氧化物酶及
21、用 TUNEL 法和荧光显微镜观测脑组织细胞凋亡形态结构的改变，评价脑 I/R 损伤。2. 用分子生物学技术（Western Blot）及免疫组织化学技术分别测定脑组织细胞硝基酪氨酸蛋白含量和组织定位，确定内源性 ONOO-在脑 I/R 损伤中的作用。3. 用比色法测定 NAD+和 ATP 水平、液闪技术测定3HNAD +水平及流式细胞仪分析技术测定 NAD(eNAD)类似物及 PARP 抑制剂 3-aminobenzamide，以评价脑组织 PARP 活性（见假说示意图） 。4. 探讨灯盏花乙素抗缺血性脑损伤的作用机制。预期结果1. 建立脑 I/R 损伤模型，阐明 ONOO-PARP 通路在脑 I/R 损伤中的地位和作用。2. 阐明灯盏花乙素抗脑 I/R 损伤的作用分子机制，为临床防治缺血性脑损伤疾患寻找抗脑I/R 损伤药物作用靶点提供实验和理论依据。3. 为我省中药灯盏花药用资源的开发和利用奠定科学实验和理论依据，创造巨大的社会和经济效益。
