1、实验 8 质粒 DNA 的提取（碱裂解法）一、实验目的了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。二、实验原理碱裂解法是利用细菌染色体 DNA 与质粒 DNA 结构的大小差异来分离质粒 DNA 的。碱性（pH 12.012.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒 DNA 的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和） ，共价闭合环状的质粒 DNA 会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体 DNA 分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒 D
2、NA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒 DNA。三、仪器设备微量取液器（2 L；20 L；200 L；1 000 L） ，tip 头，手掌型离心机， 1.5 mL 离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。四、实验试剂（1）溶液：50 mmol/L 葡萄糖；20 mmol/L TrisHCl（pH = 8.0） ；10 mmol/L EDTA（pH=8.0） ，高压蒸汽灭菌（ 121 ，0.105 Mpa ）20 min。4 贮存。（2）溶液（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。（3）溶
3、液（pH 4.8）：每 100 mL 溶液中含 5 mol/L 乙酸钾 60 mL；冰乙酸 11.5 mL； H2O 28.5 mL。（4）RNase（10 mg / mL） ，LB 液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。五、 实验方法（1）分装 3 mL LB 液体培养基和 3 L氨苄青霉素（50 mg/mL）于 15 mL 玻璃试管中。（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置 37 恒温摇床中以 200 转/min 培养，至 OD600=2.0。（3）取菌液 1.0 mL 于 1.5 mL 的 Eppendorf 管中，将离心管放入冷冻离心机，调温至
4、 4 ，转速 3 500 g，离心 5 min，收集细菌。弃上清，倒置于吸水纸上，沥干残液。（4）每离心管中加入冰上预冷的溶液 200 L，置振荡器上剧烈震荡，悬浮菌体。（5）加入新配制的溶液 400 L，翻转 10 次。冰上放置。（6）冰浴 3 min 内迅速加入 300 L 溶液，温和翻转 10 次，冰浴 10 min。（7）将离心管放入冷冻离心机，调温至 4 ，转速 12 000 g，离心 5 min。取上清液于新管中，同时加入 Rnase（10 mg/mL）10 L ，混匀，37 保温 2 hr。（8）加入等体积氯仿/异戊醇（ 24:1） ，置摇床上震荡 5 min，将离心管放入冷冻离
5、心机，调温至 4，转速 12000 g，离心 10min。 （9）取上清液于新的离心管内，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1 ） ，摇床震荡 5 min。（10）将离心管放入冷冻离心机，调温至 4 ，转速 12 000 g，离心 10 min。取上清，加入等体积异丙醇，迅速翻转 5 次，冰上放置 10 min。（11）将离心管放入冷冻离心机，调温至 4 ，转速 12 000 g，离心 10 min。弃上清，倒置于吸水纸上。加入 500 L 70 %的乙醇轻振，洗涤沉淀。（12）将离心管放入冷冻离心机，调温至 4 ，转速 12 000 g，离心 10 min。弃上清，室温干燥沉淀 30 min。（
6、13）加入 20 L无菌水溶解 DNA，电泳检测。六、实验结果七、提取质粒 DNA 过程中应该注意的问题（1）细菌细胞的裂解是分离质粒 DNA 的关键步骤。通常可以加入溶菌酶或 SDS 促使大肠杆菌细胞裂解。如果细菌细胞没有完全裂解，会明显降低质粒 DNA 的回收率。理想的状况是每一个细菌细胞都能够被充分破裂使质粒 DNA 顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。（2）质粒提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作过程中手法要温和，尽可能避免脱氧核糖核酸酶（DNase）对质粒 DNA 的降解和破坏。（3）电泳时上样孔中如果有白色物质，是由于蛋白质没有去除干净。（4）质粒
7、共有三种构型：共价闭合环形 DNA（cccDNA）：质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的 DNA 通常呈现超螺旋的 SC 构型；开环 DNA（ocDNA ）：质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一或数个缺口，即 OC 构型；线性分子（l DNA）：质粒 DNA 经过适当的核酸限制内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性 DNA分子，通称 L 构型。相同分子质量质粒的三种构型在正常情况下电泳时，迁移速率分别是：质粒 DNA 电泳图超螺旋 DNA 比线性的 DNA 迁移率大，线性 DNA 比开环 DNA 迁移率大。八、作业（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验用品及药品、实验步骤等，要详细阐述质粒提取的基本原理。（2）提取质粒 DNA 过程中应该注意的问题是什么？（3）质粒 DNA 的三种构型及在正常电泳条件下的迁移情况如何？
