1、实验二 琼脂糖凝胶的制备一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习 DNA 琼脂糖凝胶的制备方法二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA
2、分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA） 、开环分子(ocDNA) 、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5 是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链 DNA 与等长的双链 DNA 的泳动率大致相同。影响核酸分子泳动率的因素主要是
3、：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA 分子长度（bp）的负对数泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。DNA 分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNAIDNAocDNA 但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。2、支持物介质核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线
4、性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（ AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由 Acr 与 Bis 的相对比例决定。琼脂糖凝胶适合分离长度 100 至 60 的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的 DNA 分子。3、电场强度电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用
5、低电压，不超过 4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。4、缓冲液离子强度核酸电泳常采用 TAE、TBE 、TPE 三种缓冲系统，但它们各有利弊。 TAE 价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE 缓冲液。在缓冲液中加入 EDTA，可以鳌合二价离子，抑制 DNase，保护 DNA。缓冲液 pH 常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB） 。溴化乙
6、锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，出现不同的效应。254nm 的紫外线照射时，灵敏度最高，但对 DNA 损伤严重；360nm 紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对 DNA 损伤小，所以适合对 DNA 样品的观察和回收等操作。300nm 紫外线照射的灵敏度较高，且对 DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。使用溴化乙锭对 DNA 样品进行染色，可以在凝胶中加入终浓度为 0.5g/ml 的 EB。EB 掺入 DNA 分子中，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，但是如果要测定核酸分子大小时，不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸泡在含
7、0.5g/mlEB 的溶液中 1030min 进行染色。BE 见光分解，应在避光条件下 4保存。三、材料、试剂及器具 1、试剂加样缓冲液（6x）：0.25%溴酚兰， 40%蔗糖；琼脂糖；溴化乙锭（ EB） ；酶液（10mg/ml ） 。2、器具水平电泳槽、制胶板等。四、操作步骤 1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的 0.5TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。冷却至 60左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为 0.5g/ml。2、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之
8、间的缝隙。3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。5、在槽内加入 0.5TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面五、注意事项 1、电泳中使用的溴化乙锭（EB ）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。2、预先加入 EB 时可能使 DNA 的泳动速度下降 15%左右，而且对不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5g/ml 的 EB 溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB，染色步骤可省略；若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加 EB，也建议增加此步。3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。4、以 0.5TBE 作为电泳缓冲液时，溴酚兰在 0.5%1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于 300bp的线性 DNA 的泳动速度，而二甲苯青 FF 的泳动速度相当于 4Kb 的双链线形 DNA 的泳动速度。六、实验结果 凝胶的状态及胶孔的完整性七、实验报告 八、思考题 如何通过分析电泳图谱评判基因组 DNA、质粒 DNA 等的提取物的质量？
