1、实验 5 血液基因组 DNA 的纯化分离【实验目的】掌握动物全血基因组 DNA 提取的方法【实验原理】真核生物的 DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，而成熟的红细胞除禽类外没有细胞核，因此，制备 DNA 的原则是先要分离白细胞。提取 DNA 的一般过程是将分散好的白细胞在含 SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀使 DNA 从溶液中析出。【器材与试剂】1器材制冰机、冰箱、冷冻低温超速离心机、常温高速离心机、移液器，旋转摇床、恒温箱、恒温水浴箱、离心管架、真空干燥器、烧杯、试剂瓶、离心管和 吸头等。2.
2、 试剂(1) PBS-缓冲液：取 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na 2HPO4 1.44 g，KH 2PO4 0.24 g，定容至 1000 ml，高压灭菌(2) 提取液：含 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，0.1 mol/L EDTA ，0.5 % (m/V) SDS。(3) 20 mg/ml 蛋白酶 K 溶液 (4) 平衡酚(5) 氯仿(6) 10 mol/L 醋酸铵(7) 无水乙醇 (8) 70% (V/V) 乙醇 (9) TE 缓冲液【操作步骤】1. 冰冻的血样在室温水浴中融化。2. 10 ml 全血转入一个无菌的 50 ml 离心管中。3. 加入 1
3、 倍体积的 PBS 缓冲液并混匀稀释。4. 室温下，以 3,500g 的相对离心力，离心 15 min。5. 弃去上清液。6. 沉淀物中加入 3.5 ml 提取液使其悬浮。7. 然后 37 水浴 1 h。 8. 加入 25 l 20 mg/ml 的蛋白酶 K，在 6065 的恒温箱中保温 3 h。9. 加入 1 倍体积的酚(pH 8.0)，放旋转摇床口底晃动 1030 min， 以 5,000g 的相对离心力，在 4 下离心 20 min。10. 水相移到一个无菌干净的离心管中。11. 加入 0.5 倍体积的酚和 0.5 倍体积的氯仿，翻转摇动 10 min，4 下，以5,000g 的离心力，
4、离心 15 min。12. 水相移到一个无菌干净的离心管中。13. 加入 1 倍体积氯仿，翻转摇动 10 min，4 下以 5,000g 的离心力度，离心15 min。14. 水相用移液器移到一个无菌干净的离心管中。15. 加入 0.2 倍体积醋酸铵，放置冰上。16. 加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻翻转摇动，然后冰上放置 1030 min，直到 DNA 析出。17. 用一玻璃钩将白色 DNA 团钩出放进一个 1.5ml 的离心管，加入 500 l 70 %乙醇并晃动，以 5,000g 的离心力，离心 35 min，弃去乙醇，空气干燥。18. 根据 DNA 的量，加入 5001000l TE 缓冲液，保存于 4 过夜，使其完全溶解，分光光度计测定浓度后，80 保存。【思考题】动物基因组 DNA 提取的原理是什么？【参考文献】Chen H, Leibenguth F. Restriction endonuclease analysis of mitochondrial DNA of three farm animal species cattle, sheep and goat. Comp. Biochem. Physiol.1995,111B: 643-649
