1、第八章 生物样品内中药制剂化学成分的测定 一、选择题 （一）A 型题（每题的五个备选答案中，只有一个最佳答案。） 1生物样品内药物进行代谢的主要部位 A. 心 B. 肝 C. 脾 D. 肺 E. 肾 2唾液药浓一般比血浆药浓 A. 高 B. 低 C. 相等 D. 不一定 E. 以上均不是 3唾液药浓一般比血浆药浓的变化程度 A. 大 B. 小 C. 相等 D. 不一定 E. 以上均不是 4生物样品预处理时，提取次数至多几次 A. 1 B. 2 C. 3 D. 4 E. 5 5一般生物样品分析的萃取率应不低于 A. 30% B. 40% C. 50% D. 60% E. 70% 6生物样品除哪项
2、外均可用 A. 血样 B. 尿液 C. 唾液 D. 头发 E. 乳汁 7血样包括哪几种 A. 血浆、全血、血色素 B. 血浆、血清、全血 C. 血清、血色素、全血 D. 全血、白蛋白、血清 E. 血清、白蛋白、血色素 8生物样品中内源性成分是指除以下哪种以外的所有成分 A. 蛋白质 B. 多肽 C. 脂肪酸 D. 色素 E. 抗生素 9生物样品中药物的提取，对于碱性药物的最佳 pH值应高于其 pKa 值几个单位 A. 2 B. 3 C. 4 D. 23 E. 12 10生物样品分析中绝对回收率应不低于 A. 50%B. 60%C. 70% D. 80% E. 95% （二）B 型题（备选答案在
3、前，试题在后，每组若干题，每组题均对应同一组备选答案，每题只有一个正确答案。每个备选答案可重复选用，也可不选用。） A. 原型药物总量 B. 游离药物 C. 代谢物 D. 结合药物 E. 缀合物 1体内发挥药物效应的是 2目前血药浓度测定的是 3体内代谢研究对象主要是 4体内药物的存储器是 5生物利用度研究中需要测定的是 A. 以纯品进行测定 B. 空白样品测定 C. 以水代替空白样品添加对照品后测定 D. 空白样品添加对照品后测定 E. 实际样品测定 6考察提取回收率及最低检测限的是 7考察内源性物质干扰的是 8考察线性范围的是 9考察方法回收率的是 10考察最适测定浓度的是 A. 精密度
4、B. 准确度 C. 灵敏度 D. 专属性 E. 适应性 11新建立的方法与具有专属性及可靠性的方法比较，评价的是 12考察其他物质对测定组分的干扰，评价的是 13考察回收率，评价的是 14日内或日间测定结果的差异程度，评价的是 15检测限及定量限的考察，评价的是 （三）C 型题（备选答案在前，试题在后，每组若干题，每组题均对应同一组备选答案，每题只有一个正确答案。每个备选答案可重复选用，也可不选用。） A. 人体 B. 动物体 C. 两者均有 D. 两者均无 1生物样品分析对象 2临床前研究对象 3临床研究对象 4老药在某一方面的重新评价 5新药的毒理学研究 A. 母体药物 B. 代谢产物 C
5、. 两者均可 D. 两者均不可 6生物样品分析对象 7体外质量分析对象 8常具有生理活性的 9在分析前应了解哪些物质的结构 10体内药物分析可了解哪些物质在体内的变化及消除规律 （四）X 型题（每题的备选答案中，有二个或二个以上正确答案，少选或多选均不得分。） 1药物的药代动力学研究内容包括 A. 吸收 B. 分布 C. 代谢 D. 排泄 E. 溶解 2生物样品内药物分析的任务是 A. 分析方法学研究 B. 药浓监测 C. 药代动力学研究 D. 内源性物质测定 E. 控制药物含量 3生物样品内药物分析的特点是 A. 干扰杂质多 B. 样品量少 C. 药浓监测需快速提供结果 D. 药代动力学需快
6、速提供结果 E. 操作简便 4生物样品内药物分析的干扰杂质主要有 A. 内源性物质 B. 药物与内源性物质结合物 C. 代谢物 D. 共存药物 E. 外源性杂质 5选择体液或组织供生物样品内药物分析的一般原则是 A. 反映浓度与药效间关系 B. 容易获得 C. 便于处理 D. 易于分析 E. 样品量大 6最常用的生物样品是 A. 乳汁 B. 唾液 C. 尿液 D. 精液 E. 血液 7血液样品分析主要包括 A. 全血 B. 血浆 C. 血清 D. 红细胞 E. 白细胞 8药物在生物体内存在的形式有 A. 原型药 B. 结合物 C. 代谢物 D. 缀合物 E. 配离子 9生物样品的分析方法评价指
7、标有 A. 准确度 B. 精密度 C. 灵敏度 D. 专属性 E. 线性范围 10生物样品分析中与药物提取分离有关的操作步骤包括 A. 蛋白质处理 B. 液液萃取法 C. 缀合物水解 D. 冷冻干燥 E. 酶水解 二、填空题 1、开展药物的生物样品内研究，首先要解决的问题是。 2、在药代动力学研究中，常涉及药物在生物样品内的 、 、 和 等过程， 3、生物样品内药物分析对象是 和 。 4、生物样品内药物分析的目标是 和 。 5、生物样品内进行药物代谢的主要部位是 。 6、在肝脏中引起药物代谢的细胞部位主要是 中存在的。 7、血样包括 、 和 。 8、血浆的取得是加 、 、 等抗凝剂的全血经离心
8、后分取上层清液而得。 9、血清是由血液中 等影响下引起 而析出，离心后取上层清液而得。 10、目前采用血药浓度的测定方法，大都测定 。 11、体内药物清除主要是通过 ，以 、 及 形式排出。 12、生物样品中缀合物（结合物）水解常用的方法有 、 、。 13、一般生物药物分析的基本要求，萃取率应不低于。 14、根据回收率测定方法不同，可分为 和。 15、精密度可进一步分为 和 精密度。 16、生物样品中待测物的稳定性包括 、 和 。 17、长期贮存稳定性的贮存时间应超过 分析所需用的时间周期。 18、组织样品应首先制成 后再进行分离分析。 19、最常用的待测组分富集方法为 和 。 20、在样品预
9、处理过程中应注意的问题是 和 。 21、尿液与血液中药物浓度的 性不理想。 22、唾液中药物浓度比血液中药物浓度 ，但存在 的比例关系。 三、简答题 1、简述生物样品内药物分析的性质。 2、简述生物样品内药物分析在临床合理用药中的意义 3、简述生物样品内药物分析在药浓监测中的应用。 4、简述生物样品内药物分析在药代动力学研究中的应用。 5、简述生物样品内内源性物质的测定意义。 6、简述生物样品内药物分析的对象。 7、生物样品内药物分析的目标是什么？ 8、生物样品内药物分析的干扰杂质有哪些？ 9、简述药物在生物体内的存在状态。 10、生物体内进行药物代谢的主要部位有哪些？ 11、简述生物体内药物
10、的代谢反应。 12、简述尿药测定的应用意义。 13、简述血液样品的一般贮存方法。 14、简述尿液样品的一般贮存方法。 15、简述生物样品中去除蛋白质的处理方法。 16、生物样品中缀合物（结合物）的水解有哪些方法？ 17、简述生物样品的冷冻干燥处理方法。 18、简述生物样品中待测组分的富集方法。 四、论述题 1、试述生物样品内药物分析的对象与特点。 2、试述生物样品预处理的必要性。 3、试述预处理生物样品时待测物的损失与玷污。 4、试述生物样品分析方法的设定依据。 5、试述生物样品分析方法建立的一般步骤。 6、生物样品分析方法的评价内容有哪些？ 7、试述生物样品分析方法的稳定性评价内容。 8、试
11、述生物样品分析的常用测定方法有哪些。 9、试述生物样品分析中免疫分析法的分类及内容。答案： 一、选择题 （一）A 型题 1. B 解答：生物样品内药物进行代谢的主要部位是肝。 2. B 解答：唾液药浓一般比血浆药浓低。 3. A 解答：唾液药浓一般比血浆药浓的变化程度大。 4. B 解答：生物样品预处理时，提取次数至多为 2 次。 5. C 解答：一般生物样品分析的萃取率应不低于 50%。 6. D 解答：生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便、各种器官、组织以及呼出的气体等。 7. B 解答：血样包括血浆、血清和全血，其中常用的是血浆。
12、 8. E 解答：生物样品中内源性成分主要有蛋白质、多肽、脂肪酸、色素、类脂等。 9. D 解答：一般来说，碱性药物的最佳 pH 值应高于其 pKa 值 23 个单位，以利于用有机溶剂提取。 10. A 解答：绝对回收率应能达到 50%80% 。 （二）B 型题 1. B2. A3. C4. D5. A 解答：体内发挥药物效应的是游离药物；目前血药浓度测定的是原型药物总量；体内代谢研究的主要是代谢物；体内药物的存储器是结合药物；生物利用度研究中需测定的是原型药物总量。 6. C7 B8. A9. D10. A 解答：以水代替空白样品添加对照品后测定主要考察提取回收率及最低检测限；空白样品测定主
13、要考察内源性物质干扰；以纯品进行测定主要考察线性范围、最适测定浓度；空白样品添加对照品后测定主要考察方法回收率。 11 B12. D13. B14. A15. C 解答：新建立的方法与具有专属性及可靠性的方法比较，评价的是准确度；考察其他物质对测定组分的干扰，评价的是专属性；考察回收率，评价的是准确度；日内或日间测定结果的差异程度，评价的是精密度；检测限及定量限的考察，评价的是灵敏度。 （三）C 型题 1. C 2. B3. A4. B5. B 解答：人体和动物体均是生物样品分析对象；为保证安全，临床前研究对象主要为动物体；为保证药物的疗效，临床研究对象为人体；新药的毒理学研究及老药在某一方面
14、的重新评价，一般要求先在动物体上进行试验。 6. C7. A8.C9. C10. C 解答：生物样品分析对象既包括母体药物，又包括代谢产物；由于代谢产物也常具有生理活性，所以应在分析前弄清它们的结构并了解它们在生物体内的变化及消除规律；体外质量分析对象为母体药物。 （四）X 型题 1.ABCD 解答：药物的药代动力学研究内容包括吸收、分布、代谢和排泄。 2. ABCD 解答：生物样品内药物分析的任务是分析方法学研究；药浓监测；药代动力学研究；内源性物质测定等。控制药物含量为体外分析的主要任务。 3. ABC 解答：生物样品内药物分析的特点是干扰杂质多，样品量少，药浓监测需快速提供结果等。药代动
15、力学需准确，不需快速提供结果。 4. ABCDE 解答：生物样品内药物分析的干扰杂质主要有内源性物质，药物与内源性物质结合物， 代谢物，共存药物和外源性杂质等。 5. ABCD 解答：能反映浓度与药效间关系，容易获得，便于处理，易于分析是选择体液或组织供生物样品内药物分析的一般原则。样品量大小为次要因素。6. BCE 解答：最常用的生物样品是血液，尿液和唾液。乳汁，精液也是生物样品，但特殊条件下应用。 7. ABC 解答：血液样品分析主要包括全血、血浆和血清，其中最常用的是血浆。 8. ABCD 解答：药物在体内以多种形式存在，有原型药，有与生物分子形成的结合物，有代谢物，有缀合物。 9. A
16、BCDE 解答：生物样品的分析方法评价指标有准确度、精密度、灵敏度、方法专属性、线性范围及稳定性等。 10. ABCDE 解答：生物样品分析中与药物提取有关的步骤包括：蛋白质处理、缀合物水解（如酶水解）、冷冻干燥；与分离净化有关的步骤为液液萃取和液固萃取。 二、填空题 1、建立生物样品内微量药物及其代谢物的分离分析方法 2、吸收 分布 代谢 排泄 3、人体动物体 4、母体药物 代谢产物 5、肝脏 6、肝微粒体药物代谢酶 7、血浆血清全血 8、肝素草酸盐枸橼酸 9、纤维蛋白元血块凝结 10、原型药物总量 11、尿液原型代谢物缀合物 12、酸水解酶水解溶剂解 13、50% 14、绝对回收率方法回收
17、率 15、日内或批内日间或批间 16、长期贮存短期贮存冷冻-解冻循环过程标准贮备液中待测物的稳定性 17、收集第一个样品至最后一个样品 18、匀浆 19、真空蒸发直接通入气流 20、待测物的损失样品的玷污 21、相关 22、低恒定 三、简答题 1、答案要点： 生物样品内药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科，旨在通过各种分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从而为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物的
18、改进与发展作出贡献。 2、答案要点： 影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以对每一个病人都达到理想的治疗效果，为达到用药安全、合理、有效，必须设计个体化给药方案，这就需要进行治疗药物监测，以血药浓度为指标，达到个体化用药。 药物滥用、吸毒、运动员服用兴奋剂以及公安司法部门进行的法医毒物分析，均涉及到生物样品内药物（毒物）分析。阿片、颠茄、乌头、马钱子等均含有生物碱，这些物质既是药物，也是有毒物质，监测的对象也是以生物体液为主，所以生物样品内药物的分离分析方法，对滥用药物病人的求治，中毒病人的抢救，公安部门的破案均起到了重要作用。 开展上述药物的生物样品内研究，首先要解决的问题是建立生物样品
19、内微量药物及其代谢物的分离分析方法。 3、答案要点： 只有具有明确治疗范围，血药浓度和药效关系密切，且具有下列情况者，要求进行药浓监测：有效血药浓度范围窄、剂量小、毒性大的药物;药代动力学个体差异大、药理作用强、不易估计给药后的血药浓度的药物；药物的毒性反应与该药治疗的疾病症状相似，难以判断是剂量不足还是药物毒性所致;联合用药时，由于药物相互作用产生不良反应，需要调整药物剂量者；在短期内难于判断疗效的药物，预测药物能否达到预防效果；判断患者用药的依从性等要求进行药浓监测。 4、答案要点： 在药代动力学研究中，常涉及药物在生物样品内的吸收、分布、代谢和排泄等过程，常研究药浓时间曲线的变化。样品中
20、药物浓度高低差别大，且通常要测定药物及其代谢物，因此要求分析方法必须具有足够的灵敏度和选择性。 5、答案要点： 生物样品内内源性物质如氨基酸、激素类、肌酐、儿茶酚胺、过氧化脂质、草酸、尿酸等，在机体正常生理条件下均处在一定的浓度范围内，当这些物质在生物样品内的含量发生 明显变化或出现异常时，指示机体发生了病变。因此，测定生物样品内内源性物质的含量，对于疾病的诊断或及早预防具有重要的意义。 6、答案要点： 凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、组织、排泄物等都是分析的对象，所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便、各种器官、组织以及呼
21、出的气体。 生物样品内药物分析对象不仅是人体，也包括动物体。 7、答案要点： 生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物样品内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。 8、答案要点： 体液和组织中的内源性物质，如蛋白质、多肽、脂肪酸、色素等，不仅能同药物结合，而且还常常干扰测定。代谢物、共存药物及各种外源性杂质都会干扰测定，因此，通常要对样品进行分离、纯化后再分析。同时生物样品中有多种代谢酶，取样后仍可作用被测物，使被测物不稳定。 9、答案要点： 药物进入生物样品内后，要经过
22、吸收、分布、代谢和排泄等过程，血液成为药物在生物样品内转运的枢纽，绝大多数药物借助血液分布到作用部位或受体部位。一部分药物在血浆中与生物大分子蛋白质结合，不能自由地透过细胞膜，但这种结合是可逆的。药物到达受体、组织后又可与受体、组织结合，处在动态平衡状态。药物经生物转化生成的代谢物也同样具有上述与生物大分子结合的性质，因此生物样品内的药物量还是经常保持在某一水平，而随时间在不断变化。 10、答案要点： 生物样品内进行药物代谢的主要部位是肝脏，此外，肾、脾、肺、肠粘膜、胎盘等组织也有一定活性，但远比肝脏低。在肝脏中引起药物代谢的主要是在肝微粒体中存在的药物代谢酶。 11、答案要点： 生物体内药物
23、的代谢反应可分为一相（第一阶段）和二相（第二阶段）代谢转化，两相反应均受相应的药物代谢酶催化。一相代谢是指药物在以细胞色素 P450 为核心的混合功能氧化酶等催化下发生氧化、还原、水解等反应，使药物分子结构增加了极性基团，水溶性增强，药物的活性发生改变（灭活、激活或作用类型改变）。二相代谢是指药物或经一相反应后的代谢物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶等催化下，与葡萄糖醛酸、硫酸盐等结合，使药物分子的极性进一步增大，有利于从尿中排泄，结合过程通常使药物灭活。 12、答案要点： 尿药测定主要用于药物剂量回收、药物肾清除率及代谢物类型等研究，也可用于乙酰化代谢和氧化代谢多态性等研究，体内药物清除主要是
24、通过尿液排出，药物以原型或代谢物及缀合物形式排出。 13、答案要点： 用血浆、血清作为样品时，应尽快从全血中离心分离出血浆、血清，一般最迟不超过 24 小时，分离后再冰冻保存。若不预先分离，则冰冻易引起细胞溶解，阻碍血浆或血清的分离，同时溶血会影响药浓变化。 14、答案要点： 尿液主要成分是水、尿素及盐类，这是很好的细菌生长液，所以应在取样后立即测定，若收集 24 小时或更长时间的尿样或不能立即测定时，应置 4 冰箱保存；若在室温保存，应在采样后立即加入防腐剂；若需放置较长时间则需冷冻贮存。 15、答案要点： （1）利用蛋白质脱水沉淀：采用有机溶剂如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等，或中性盐如硫酸铵、
25、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质脱水而沉淀。用乙腈除去蛋白质，产生的沉淀容易分离，应用比较广泛，当用 13 倍体积的有机溶剂时，可使 90%以上的蛋白质沉淀。 （2）利用蛋白质形成不溶性盐沉淀：常用的为酸性沉淀剂，如三氯醋酸、高氯酸、苦味酸或重金属离子等使蛋白质沉淀。 （3）其他方法：加热使蛋白沉淀，适用于样品对热稳定者。可将样品置沸水浴中，使蛋白质直接变性生成沉淀。或者采用超滤和透析方法，除去体液样品中的蛋白质，但费时，在分析大量的样品时，受到一定的限制。应用超滤和透析方法，在处理过程中样品内蛋白质并未变性，结合的待测成分未能被解脱出来而不能检出，此方法可测得血清或血浆中游离的待测成分的浓度。 16
26、、答案要点： 药物在生物样品内经二相代谢后，在血浆及尿中呈缀合物形式存在，最常见的有葡萄糖醛酸苷和硫酸酯。含有羟基、羧基、氨基、巯基功能团的药物分子可与葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物，具有酚羟基的药物、芳胺及醇类药物则与硫酸形成硫酸酯缀合物。它们的极性均较母体药物大，是亲水性的或在生理 pH 值下是电离的，不易被有机溶剂提取，需要作水解处理，使缀合物中的药物或代谢物游离出来，再用有机溶剂提取。常用的缀合物水解方法有：酸水解、酶水解、溶剂解。 17、答案要点： 冷冻干燥是对某些生物样品进行贮存和预处理的有效方法。此法适合于一次不能完成分析的大批量生物样品、水溶性很强的样品、挥发性样品和对热不稳
27、定的样品。 生物样品的冻干处理可用干冰丙酮浴或用液氮进行。经冻干处理后样品中的水分和其他挥发性杂质因升华而被除去，使样品达到干燥。如此处理的样品，常常可加入适当的有机溶剂后直接测定。样品冻干处理时，在挥发或升华过程中有可能损失一部分药物，对此，可先进行衍生化处理，降低挥发性后再行冻干处理。 18、答案要点： 提取所得溶剂量常为数毫升，往往还不能直接供 GC、HPLC 测定。因受进样量的限制，所以需要采取浓集办法。最常用的方法为真空蒸发（注意防止暴沸）或直接通入气流使溶剂挥发。一般通入压缩空气，遇氧不稳定的组分可改用氮气。根据溶剂的挥发性和组分的热稳定性，必要时可将提取液置一定温度的水浴中，以加
28、快挥发。 四、论述题 1、答案要点： （1）.生物样品内药物分析的对象 凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、组织、排泄物等都是分析的对象，所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便、各种器官、组织以及呼出的气体。 生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物样品内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。 由于新药进入临床试验之前，或者对老药在某一方面的重新评价，一般要求先在动物身上进行实验，所以生物样品内药物分析对象
29、不仅是人体，也包括动物体。 （2）.生物样品内药物分析的特点 与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。在生物样品内药物分析中，微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况而有所不同。很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合，这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法具有更高的选择性。另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血药浓度在 10-6g/mL10-9g/mL 之间，且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法有较高的灵敏度。 生物样品内药物分析具有干扰
30、杂质多、样品量少、要求较快提供结果等特点。 2、答案要点： 根据生物样品内药物分析的对象和特点以及药物在生物样品内的存在形式、生物转化状况，欲进行体内药物及其代谢物测定，除少数情况将体液作简单处理后进行直接测定外，一般在测定之前需采取适当的样品预处理，即进行分离、净化、浓集、衍生化等，从而为药物的分析测定创造良好的条件。 药物在体内以多种形式存在，有原型药（游离型），有与生物分子形成的结合物（与蛋白结合型），有代谢物，有缀合物（与葡萄糖醛酸、硫酸形成的苷、酯等），需分别测定；待测物浓度很低，而生物样品的介质组分繁杂，有众多内源性成分（蛋白质、多肽、脂肪酸、色素、类脂等）和各种潜在的干扰物存在，
31、还有一些共存药物以及各种外源性物质也会影响测定；待测药物类型众多，性质各异很难对样品规定固定的程序和方式，所以样品处理必须根据药物类型、理化性质、存在形式、浓度范围、测定目的、选取的生物样本类型及最后一步测定方法等多种因素，采取相应的分离步骤和净化技术。 3、答案要点： 在样品预处理过程中待测物的损失，是由容器的吸附、蛋白共沉淀、药物不稳定而产生化学降解或与重金属离子配合、衍生化反应不完全、浓缩过程中挥发等因素所致。样品的玷污问题，是由于生物样品内药物测定具有在复杂体系中测定痕量物质的特点，内源性和外源性污染将引起测量结果不可靠，误差变大。在通常实验环境中，所用器皿、材料（塑料、润滑油、滤纸、
32、蒸馏水纯度等）、提取溶剂和衍生化试剂中夹杂的杂质、血样中脂肪酸及其酯类、人体的皮肤、手指接触容器所带入的杂质等都有可能玷污样品。以上这些问题严重时，会使整个测定毫无意义，甚至引起错误判断。 4、答案要点： （1）在做好文献总结及整理工作的基础上充分了解待测药物的特性与生物样品内状况。药物的理化性质包括酸碱性（pKa）、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、稳定性等，生物样品内药物分析的对象是来自生物体内的样品，因此对药物在生物样品内的状况必须了解，如药动学参数、生物样品内代谢情况等。这涉及样品取样频率与间隔、分析方法的选择等。 （2）明确测定的目的和要求。应了解拟建立的方法是用于测定药代动力学参数，
33、还是用于临床药浓监测。前者要求具有一定的灵敏度和准确度，不强调简便、快速，设计方法时应考虑到不同时间获得的样品中药物浓度变化较大这一因素。而用于临床药浓监测，则要求方法简便、快速。另外，是否要求同时测定母体药物和代谢物，若需同时测定两者，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。同时，结合实验室条件，选择可行的方法。 5、答案要点： （1）以纯品进行测定 取药物或其代谢物纯品适量，按拟定方法测定，求得浓度与测定响应值之间的关系，进行线性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最适条件（如 pH 值、温度、反应时间等）等的选择。 （2）空白样品测定 取空白生物样品，按拟定的方法进行处理，测定空白值（或色
34、谱图）。空白值高低或色谱图状况将影响到方法的灵敏度和专属性，应力求将空白值降低。在色谱分析中应力求减少样品中内源性杂质峰，对无法消除的内源性杂质峰应设法使其从待测物的色谱区域内移开。能否取得良好的样品空白实验结果，是决定测定方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。 （3）以水代替空白样品，添加对照品后测定 .以水代替空白生物样品，添加一定量对照品后按拟定方法进行测定，以了解提取回收率及最低检测浓度的大致情况，从而对提取溶剂、富集方法等条件进行选择。 （4）空白样品中添加对照品后测定 于空白生物样品中，添加一定量对照品后按拟定方法进行测定，求得样品回收率数据，建立标准曲线。若采用色谱法测定，若需
35、要用内标法定量，则应首先选择合适的内标物，然后进行回收率的测定。 （5）生物样品内实际样品测定 6、答案要点： 评价一个生物样品内药物分析方法的优劣主要有以下几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及对生物样品的适应性等。 准确度 准确度是方法评价的最基本要点之一。将已知量的药物纯品加到空白样品（如血样）中经过一系列的处理、测定，所得药物量与加入量之比值的百分率即为回收率。根据回收率测定方法不同可分为绝对回收率和方法回收率。 （1）绝对回收率又称萃取回收率、提取回收率，它反映了一个方法的萃取效率，与生物样品内样品检测灵敏度有关，是评价生物样品内药物分析方法
36、的重要指标之一。 （2）方法回收率是取一系列浓度的药物对照品加到空白体液中，按设定方法测定，根据对照品浓度及响应信号值绘制标准曲线，然后取高、中、低浓度的药物对照品添加到空白体液中，按标准曲线制备方法同法测定，求得测定值。最后与加入量比较，得方法回收率。 精密度 精密度是表示一组测量值彼此符合的程度。精密度测定通常采用高、中、低三种浓度进行测定。低浓度选择在定量限（LOQ）附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度，精密度可进一步分为日内或批内精密度和日间或批间精密度。前者表示一次测定的重复性，后者表示不同时间测定结果的重复性。 灵敏度 灵敏度是指一种方法可以检测出有关化合物的最小量。
37、检测限表示在生物介质中药物的最低可测度（或绝对量）。通常以被测信号和背景噪音比 S/N 为 23 倍时的被测物的绝对量来表示。 定量限是指生物介质中药物可定量测定的最低量，表示方式和测定方法与检测限相同，它与检测限的不同在于定量限规定的最低测得浓度应该符合一定精密度和准确度的要求。 最低检测浓度则多指可进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因素有关， 方法的专属性 方法的专属性，也称选择性，是指样品中含有其他共存物质时，该法定量测定被测物的能力。即测定的信号应是属于被测物所特有的，否则就易受干扰。考察一个方法是否专属，应着重考虑代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰。 线性范围线
38、性范围通常是将药物对照品加入空白体液中，制成一系列不同浓度的标准液，按规定方法处理、测定。根据药物对照品浓度和响应信号值绘制标准曲线，或计算回归方程，求出 r 值和浓度范围。 稳定性 药物的稳定性是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数。在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。在生物样品中待测物的稳定性包括长期贮存、短期贮存和冷冻-解冻循环过程的稳定性，也包括标准贮备液中待测物的稳定性。 7、答案要点： 药物的稳定性是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数。在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。在生物样品中待测物的稳定性包括
39、长期贮存、短期贮存和冷冻-解冻循环过程的稳定性，也包括标准贮备液中待测物的稳定性。 （1）长期贮存稳定性 长期稳定性的贮存时间应超过收集第一个样品至最后一个样品分析所需用的时间周期。贮存温度一般为-20，如果需要也可在-70贮存。要求高、低浓度至少分别测定 3 次，与第一天测得的相应浓度的结果进行比较。 （2）短期室温稳定性 高、低浓度各 3 份于室温下放置 424 小时（根据实际操作在室温中需维持的时间而定），在不同时间点取样，进行分析，与 0 小时测得结果进行比较。 （3）冷冻-解冻稳定性 取高、低浓度样品至少各 3 份，于-20贮存 24 小时，取出置室温放置使自然融解。当融解完全后，取
40、样，进行分析。然后再把样品放回冷冻状态保持 1224 小时，如此解冻-冷冻应重复循环二次以上，然后比较各次分析结果。 （4）贮备液稳定性 药物与内标物贮备溶液的稳定性应对其在室温下至少 6 小时的稳定性进行考察，然后将其冷藏或冷冻 714 天或恰当周期后进行测定，所得仪器响应值与新鲜配制溶液所得响应值进行比较。 8、答案要点： （1）光谱法 采用具有选择性的显色剂和反应条件，才可以不经分离提取，直接用比色法测定生物样品中的药物含量。比色法灵敏度不高，通常只能测定出 1g/mL 浓度以上的样品。但该法快速、简便，对仪器设备要求不高。 荧光法具有较高的灵敏度，专属性也较强，但药物必须具有一定的化学
41、结构才能产生荧光。药物中具有天然荧光者不多，通常需采用适当处理，常用化学引导荧光法，如紫外辐射氧化、水解或强酸脱水等，或用适当的荧光试剂与药物起偶合或缩合反应，产生荧光发生团。 （2）色谱法 经典的薄层色谱定量法，操作比较繁琐，准确性较差。不适用于体液中药物成分浓度的测定。高效薄层色谱法灵敏度较高，常用于生物样品中成分的测定，与气相色谱法、高效液相色谱法相比，也有其独特的优点， 高效液相色谱法在生物样品内药物分析中的应用已大大超过了其他分析方法。具有适用范围广，可在室温下进行；样品预处理简单；分离效率高，流动相选择范围广；可不经萃取和衍生化处理直接测定极性大的水溶性药物；检测方法多是非破坏性的
42、，流出组分可回收；专一性较高等优点。 气相色谱法只要选择适当的色谱条件，母体药物、代谢物及其可能同时服用的其他结构相类似的药物都能得到很好分离，常作为建立其他生物样品内药物分析方法的参比方法。 高效毛细管电泳法有高压电泳的高速、高分辨率及高效液相色谱法的高效率等优点，其选择性与高效液相色谱有很大的互补性。广泛应用于生物大分子，体内药物及代谢物，手性药物，中、西药物及其制剂等的分析。 （3）联用技术 联用技术已广泛应用于复杂组分的分离与分析，成为分析技术中最重要的检测手段，尤其适合于对热不稳定的、挥发性差的或极性大的成分分析，高分辨的液相色谱与高灵敏度的质谱联用分析，特别适用于复杂生物样品中药物
43、及其代谢物的研究。 （4）免疫分析法 免疫分析中按标记物的不同，可分为放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析等。根据抗原-抗体的反应达平衡后是否需将结合物（B）与游离标记物（F）分离，免疫分析可分为均相免疫分析和非均相免疫分析两大类。 各种免疫分析的基本原理是一样的，即竞争抑制原理。人工抗原的制备和特异抗体的制备也相同，只是标记抗原（标记药物）的标记物不同，由此产生的测定方法也不同。 9、答案要点： 免疫分析中按标记物的不同，可分为放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析等。根据抗原-抗体的反应达平衡后是否需将结合物（B）与游离标记物（F）分离，免疫分析可分为
44、均相免疫分析和非均相免疫分析两大类。 各种免疫分析的基本原理是一样的，即竞争抑制原理。人工抗原的制备和特异抗体的制备也相同，只是标记抗原（标记药物）的标记物不同，由此产生的测定方法也不同。 放射免疫分析是 20 世纪 50 年代末开始发展起来的一种超微量分析技术，它是利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素体外检测法。本法最早应用于血浆中微量胰岛素的分析，这一方法不仅用于测定大分子量、有抗原性的蛋白质、酶等生物活性物质，而且也广泛用于测定许多小分子量、本身无抗原性的药物和代谢物等，许多 RIA 药盒已商品化。 酶免疫分析是 20 世纪 70 年代在 RIA 基础上发展起来
45、的一种新的免疫分析方法。将抗原抗体特异反应与酶的高效专一催化特性相结合，用酶代替放射性同位素来标记药物，具有无放射性危害，标记物衰退期长和仪器设备简单等优点，随着研究进展，EIA 的灵敏度已达到甚至超过 RIA，凡 RIA 能测试的项目几乎均可用 EIA 来替代。 标记酶的作用也是提供可测信号，但酶本身并不能直接发出信号，必须要有其他物质如酶底物、辅酶等的参与才能完成酶反应，引起吸收光谱等方面的变化以供检测。 按照测定过程中，抗原-抗体反应是在单一液相中进行还是在液固相中进行，可将 EIA 分为均相酶免疫分析法和非均相酶免疫分析法。 一些化学物质在氧化时会发出光量子，这种氧化反应称化学发光，具
46、有这种性质的分子称化学发光分子，用它标记抗原或抗体，以达到测定抗体或抗原为目的的标记免疫技术，称化学发光免疫测定法。自 1976 年 Schroeder 等首先建立了生物素 CLIA 后，激素等众多物质的 CLIA 也相继建立，并在不断发展中。CLIA 也有均相与非均相两种类型。 荧光免疫分析是以荧光物质或潜在荧光物质为标记物，当标记的药物与特异抗体相结合时，发生荧光强度的改变，或在相应的酶作用下发生荧光来检测待测样品中药物浓度的一种方法。也可分为均相与非均相两类，均相荧光免疫分析能自动化操作，是目前应用比较广泛的免疫分析法。按标记物产生荧光方式不同，可将荧光免疫分析分为底物标记荧光免疫分析、荧光偏振免疫分析、荧光淬灭和荧光增强免疫分析等。
