1、罗氏(Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核 DNA 的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在
2、凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3-OH 形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、 器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含 TdT 10、荧光素标记的 dUTP 1、标记荧光素抗体的 HRP；自备试剂：PBS 、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、8
3、0 、70%）、DAB 工作液（临用前配制，5 l 20DAB+1L 30%H2O2+94 l PBS）、Proteinase K 工作液（10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。三、 实验步骤操作流程图：制作石蜡切片脱蜡、水合细胞通透加 TUNEL 反应液加converter-P
4、OD与底物 DAB 反应显色光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min；2. 用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用 Proteinase K 工作液处理组织 15-30 min 在 2137C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液 8min；5. PBS 漂洗 2 次；6. 制备 TUNEL 反应混合液，处理组用 50l TdT+450l 荧光素标记的 dUTP 液混匀；而阴性对照组仅加 50l 荧光素标记的 dUTP 液，阳性对照组先加入 1
5、00l DNase 1，反应在 152510min，后面步骤同处理组。7. 玻片干后，加 50l TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加 50l 荧光素标记的 dUTP 液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 371h。8. PBS 漂洗 3 次；9. 可以加 1 滴 PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为 450500nm，检测波长为 515565nm）；10. 玻片干后加 50l converter-POD 于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 3730min。11. PBS 漂洗 3 次；12. 在组织处加 50100 lDAB 底物，反应 152510min；13.
6、 PBS 漂洗 3 次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴 PBS 或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计 200500 个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注 4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后 4保存；适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约 110
7、6个细胞，PBS 洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；将吸附细胞的载玻片在 4%多聚甲醛（见备注 2）中固定 25min；PBS 浸洗二次，每次 5min；将吸附细胞的载玻片在 0.2%的 Triton X-100（见备注 5）中处理 5min；PBS 浸洗二次，每次 5min；后续操作如同石蜡包埋切片的 615四、 注意事项1. 进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 min。2. PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样
8、可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL 反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果 20DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用甲基绿（ Methyl Green）染液（3-5% 甲基绿溶于 0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100% 乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用 8090%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 荧光素标记的 dUTP 液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20 （-1525）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在 4（28 ）下，至少在 6 m 内稳定，避免再次冻存；TUNEL 反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量 DNA 片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA 断裂或 DNA 裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止 TdT 进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
