1、动物细胞的培养、冻存与复苏1熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。2了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。3了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。【实验原理】细胞培养(cellculture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细
2、胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响。细胞培养可分为原代培养和传代培养 2 种情况。所谓原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。而传代培养(subculture)是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以 1：2 或其他比例转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。传代培养可简称传代。在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖，需经常对其进行传代。传代的累积次数就是细胞的代数。在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株(cell strain)这两个容易
3、混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体所组成；而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持续存在。细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响，故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、pH 值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作，
4、这是细胞体外培养成败的关键。【器材与试剂】1器材：恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、普通离心机、倒置相差显微镜、真空泵、电热高压蒸汽消毒锅、解剖剪、眼科剪、解剖镊、培养瓶(15m1 或 25m1)、表面皿、培养皿、吸管、玻璃除菌滤器(G5 或 G6)、小烧杯、离心杯、青霉素小瓶、血球计数板、吸管橡皮头、橡皮瓶塞、酒精灯、试管架、记号笔、75酒精棉球、口罩、袖套。2材料：新生乳鼠。3试剂：1640 培养液(含 20小牛血清)、0.25胰蛋白酶液、磷酸缓冲液(PBS)、小牛血清、青霉素、75酒精、5NaHCO 3液、0.85NaCl 液、三蒸水或双蒸水、二甲亚砜(DMSO)、丙三醇(甘油)。 4
5、试剂的配制：(1)1640 培养液：用天平称取 RPMI1640 培养基粉剂若干克(依实验所需培养液的总量而定)倒人烧杯中，按说明书要求加入三蒸水、NaHCO 3、谷氨酰胺，利用磁力搅拌器使加入的固体物完全溶解，然后加入适量浓度为 20000 单位ml 的青霉素和链霉素，使培养液中这两种抗菌素的浓度分别达到 100 单位ml。再按比例加入小牛血清，使其在培养液中的含量达到 20，将溶液充分混匀，用 5的 NaHCO3和 1mol/L 的 HCl 调培养液的 pH值至 7.07.1。最后用 G5 或 G6 型玻璃除菌滤器负压抽滤除菌。(2)PBS(不含钙镁，pH7.2)：分别称取 NaCl 8.
6、00g、KCl 020g、Na 2HPO4 1.15g、KH 2O4 0.20g，加三蒸水溶解并定容至 1000ml。(3)DHanks 液：DHanks 原液：分别称取 NaCl80.0g、Na 2HPO42H2O 0.6g、KCl4.0g、KH 2P040.6g、NaHC0 3 3.5g，加三蒸水溶解至 1000ml。配制时要注意按了顷序逐一加入溶解，应等前一种药品完全溶解后再加下一种药品，原液配好后应分装于 250mi 或 500ml 玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内贮存。DHanks 工作液：取 DHanks 原液 100ml，加三蒸水 896ml，再加 0.5的酚红溶液 4ml，混合均匀
7、即成。(4)0.25胰蛋白酶(pH7.27.6)：称取活性为 1：250 的胰蛋白粉剂 0.25g，另准备 DHanks 工作液 100ml。先用少量 DHanks 工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将剩余的 DHanks 工作液全部加入，充分搅拌使酶充分溶解，必要时可将容器置于 36恒温水浴箱中，直至酶液清亮，再用 NaHC0，调 pH 至 7.27.6。然后用玻璃滤器除菌，分装于青霉素小瓶中，密封后置冰箱冷冻室(18)中贮存。(5)05酚红溶液：称取 0.5g 酚红粉置干燥研钵中研磨均匀，边磨边加入0.1movl/L NaOH 12ml，使之完全溶解，然后加三蒸水至 100ml，4冰箱保存。(
8、6)细胞冻存培养液：在含 2030小牛血清的 1640 培养液中加入二甲亚砜，使其终浓度为 10(或加入丙三醇并使终浓度为 5)。【内容与方法】一、实验过程中无菌操作的要求 在整个细胞体外培养过程中，要始终保持无菌的概念，在操作的众多环节中要注意消毒灭菌，努力做到最大限度的无菌，严防细菌的污染，否则将导致细胞培养的失败。1培养用品的清洗消毒：实验中所需的玻璃器皿(如培养瓶、离心管、吸管、小瓶等)和器械(如剪刀、镊子等)应彻底清洗干净，干燥后用牛皮纸包好置高压蒸汽消毒锅中消毒灭菌(蒸汽压力为 103kPa，20 分钟)。而培养液、PBS 液、胰蛋白酶液、Hanks 液、细胞冻存液等应利用抽滤法除
9、菌。将已消好毒的实验所需物品收集并清点好置于超净工作台内，避免实验开始后再从工作台外取物而受污染。为操作时方便，工作台内的用品应合理布局，原则是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧，酒精灯放在中央。 2超净工作台的消毒：超净工作台在使用前可用 75酒精纱布将其内部揩擦一遍进行初步消毒，然后打开工作台内的紫外线灯照射消毒 20-30 分钟。照射杀菌完毕后关闭紫外线灯并同时打开风机，由于进人工作台内的空气是经过工作台上的除菌滤板过滤的，故工作台内是一个相对无菌的环境。3手的消毒：操作时双手及前臂要伸人超净工作台内，故事先双手必须用肥皂刷洗干净，然后只 75的酒精棉球擦拭消毒。在夏
10、季，手的刷洗和消毒应至肘部；在冬季，双手消毒后进人工作台前应戴工无菌的袖套。4操作过程中的消毒：在超净工作台中开始操作时首先应点燃酒精灯，此后的一切操作如打开或加盖瓶塞、安装吸管皮头、使用吸管、使用各种金属器械等均要经酒精灯的火焰烧灼或在火焰旁进行掳作。培养操作时，动作要准确敏捷，不能用手触及器皿的消毒部分，如不慎触及，要用火焰消毒或更换，开盖的培养液或培养用瓶应尽量保持斜位放置或平放，以避免瓶口长时间直立而增加细菌污染的柳会。吸取不同液体时应分别使用不同的吸管，不要混用以防扩大污染。二、细胞的原代培养(一)单层细胞培养法(乳鼠肺组织细胞培养)1取材：(1)取新生乳鼠一只，用颈椎脱臼法处死后立
11、即浸人盛有 75酒精的烧杯中消毒处理 23 秒钟，取出后立即放人超净工作台内的无菌培养皿中。(2)打开无菌器械包，左手用镊子提起小鼠腹部皮肤，右手用解剖剪剪开腹腔和胸腔，可同时剪去部分胸壁以充分暴露胸腔。(3)用另一镊子轻轻夹起粉红色的肺组织并将其剪下，放人另一培养皿中。(4)用吸管吸取 PBS 液或 Hanks 液将培养皿中的肺组织冲洗 3 次以除去血污，然后将肺组织剪成若干块，再用 PBS 液或 Hanks 液漂洗，除净血液。2消化：(1)将洗净的肺组织块移人无菌的青霉素小瓶中，用小剪刀伸人瓶内将组织块反复剪成约 05mm 3的小块。(2)加入组织块 58 倍量的 0.25胰蛋白酶液，混匀
12、后加盖放人 37水浴箱中消化处理 20-30 分钟。胰蛋白酶的消化作用能除去组织中的细胞间质，使组织松散成单个细胞或较小的细胞团。其间每隔 5 分钟轻摇 1 次。(3)当组织被消化得差不多时(看上去组织块变得较为疏松，颜色变白)，将小瓶从水浴中取出拿回超净工作台，用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态，加入 12ml 培养液混匀，使消化作用中止。4)将小瓶静置片刻，使瓶内未被消化完的组织块自然下沉，然后将细胞悬液移人无菌的离心管中并加盖橡皮塞。3离心：将离心管作好标记，平衡后放人离心机中以 1000r分钟的速度离心 8分钟。4计数：离心完成后，将离心管拿回超净工作台内，用吸管
13、吸去上清液，再加入3m1 培养液吹打混匀。用吸管吸取少许细胞悬液滴人血球计数板的小室中，在光镜下计数(计数方法详见实验六)。根据计数结果，将细胞悬液中的细胞浓度凋整至 5105ml 左右。5接种：调整好细胞浓度后，往每只培养瓶(25m0 接种 lml 细胞悬液，另添加培养液4ml，轻轻混匀后盖紧瓶塞，用记号笔标上细胞名称、日期等，放人 37恒温培养箱中培养。6培养与观察：对培养中的细胞每天都应做常规性检查，主要观察细胞生长状态、是否出现细菌等微生物的污染、培养液的酸碱度。如果没有发生污染，24 小时后在光镜下便可见到许多细胞贴壁，培养至 34 天时，可见细胞增殖后在瓶中形成许多细胞岛并逐渐扩展
14、。一般培养至 710 天时细胞可基本铺满整个瓶壁，形成致密单层，其间如果培养液变黄(pH 值下降)，可换液一次。(二)组织块培养法（乳鼠肾细胞培养）1取材：取材操作的前面几个步骤同单层细胞培养法。当剪开乳鼠腹腔后，将位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下，放人培养皿中，用 PBS 液或 Hanks 液反复冲洗 3 次以去除血污。将洗净的肾脏移人无菌的青霉素小瓶中，再用锋利的小剪刀将肾脏剪成 0.51mm3的小块，用吸管吸取 1-2ml 培养液将剪刀上的组织块冲人瓶中，轻轻吹打混匀，等小块下沉后吸弃部分上清液，留下少许制成组织块悬液。 2接种：(1)用吸管分次吸取小块组织悬液于培养瓶中(操作时应轻按吸管
15、皮头而不要用力，使组织块被吸在吸管口端，避免吸得过高而使组织块粘附在管壁)。(2)用小镊子使组织块在培养瓶壁上散开摆匀(小块间的距离约为 0.5cm)。轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上(注意不要使组织块流开)。(3)往培养瓶中加入 2-3m1 培养液，盖好瓶塞，做好标记后放人 37恒温培养箱中处理 2fu4 小时，使组织小块能牢固贴到瓶壁上。(4)待组织块贴壁后，慢慢小心地翻转培养瓶(注意减少振动以避免组织块脱落)，使培养液缓缓覆盖组织块。3培养与观察：将接种好的培养物放入 37恒温培养箱中静置培养，3 天后开始观察。在倒置相差显微镜下将组织小块逐个移入视野，可见组织块周围有不规则形态的游走细胞，再向
16、外则是一些贴壁的成纤维细胞或上皮样细胞。当细胞增殖旺盛时，在组织块周围可见到生长晕。此后呈放射状向外扩展逐渐连成片，大约经 1015 天便可形成细胞单层，其间如培养液变酸发黄，应注意更换。三、细胞的传代培养当培养瓶中的细胞已长成致密单层时即可进行传代培养，其操作步骤如下。1准备：(1)将所需培养用品清洗消毒后放人超净工作台内并摆好，紫外线消毒 30 分钟。(2)将已形成致密单层细胞的培养瓶从培养箱中取出放人超净工作台中。(3)点燃酒精灯，在酒精灯旁将培养液倒人一小烧杯中 o2 消化：(1)往培养瓶中加入消化液(025的胰蛋白酶)58 滴，轻摇培养瓶，使消化液湿润整个细胞单层，置室温下 23 分
17、钟。(2)翻转培养瓶使其底都朝上，用肉眼察看细胞单层，如细胞单层上出现空隙(约针孔大小)时即可倒去消化液；如果未见空隙，说明消化程度不够，可将消化时间稍延长；如果发现细胞已大片脱落，说明已消化过头，在这种情况下不能倒出消化液，而应直接进入下步操作。3终止消化：往培养瓶中加入 3-4ml 培养液以终止胰蛋白酶的消化作用，用吸管吸取瓶中的培养液反复冲击瓶壁上的细胞，直至全部细胞被冲下，轻轻混匀制成细胞悬液。4计数：吸取少量细胞悬液于血液计数板的小室中，光镜下计数，根据结果将细胞浓度调整至 5105mi(该步骤可省去)。5传代：吸取 1ml 细胞悬液移久另一培养瓶中，原培养瓶中留下 1ml 细胞悬液
18、(其余弃去)，并向每瓶中加入新培养液 4ml，盖好瓶塞，轻轻摇匀后置 37恒温箱中培养。6观察：传代后每天应对培养的细胞进行观察，若细胞贴壁存活则称为传了一代，如培养液变酸发黄要及时更换。四、体外培养细胞的冻存与复苏体外培养细胞的传代及维持在培养用具、培养液、无菌操作及准备工作等方面均需花费较多的人力和物力，而且细胞在体外培养过程中所传的代数往往是有限的，一般繁殖到50-60 代就会老化衰亡。另外，在传代的过程中细胞的表型会发生改变，因此，在体外培养过程中，常需要对细胞进行冷冻保存以减少工作量，防止细胞因传代过多发生变异甚至死亡。冻存的细胞可为进行某个研究方面的重复实验提供永久的材料来源。在一
19、般低温条件下，活细胞内外可出现对细胞有机械损伤作用的冰结晶，而且随着冰结晶数量的增多，会导致细胞的脱水及渗透压上升等后果，这些也可造成细胞的损伤。为了避免冷冻时出现细胞损伤，研究者们发明了在培养液中添加保护剂的方法。作为保护剂应具备亲水性、易透过细胞膜及毒性小等优点。目前广泛应用的是丙三醇和二甲亚砜 2种，它们可使细胞在冷冻时免受由于冰晶形成和渗透压改变而导致的损伤。现在务实验室所采用的细胞冻存温度是液氮温度(196)，这是大多数细胞样品的最佳储存温度。例如人的红细胞在液氮中可储存 12 年而未表现出明显的生化及生理功能改变。另一方面，为了减少冰晶对细胞的伤害，保证冻存效果，选择最佳的降温程序
20、和速度也很重要。目前多采用的降温程序是分段降温法，即利用不同温级的冰箱或液氮贮存罐，将活细胞在不同的温度段分段降温冷却，例如从室温降至 4，再依次降至-40、80、196(在各温度段持续时间视细胞的类型而定 )。关于最佳降温的速度，不同类型的细胞相差较大，与细胞的性质特别是质膜的渗透率有关。般来说，以每分钟下降110的速度可得到良好的效果。目前最广泛使用的冷冻剂是液氮，其沸点是196。液氮对细胞材料的 pH 值没有影响，气化时也不留沉淀。在体外培养的细胞，从增殖期到形成致密单层前的细胞都可用于冻存，但一般认为处于对数生长期的细胞用于冻存效果最佳。当需要使用冻有的细胞时，可加温使之复苏，复苏后的
21、细胞可继续培养增殖用于研究或实验。冻结的细胞复苏要以快速融化为原则，以防小冰晶变为大冰晶而对细胞造成损伤。(一)培养细胞的冻存1准备工作：(1)细胞冻存液的配制：在含 2030的小牛血清的 1640 培养基中加入二甲亚砜，使其终浓度为 10(或者加入丙三醇并使终浓度为 5)。(2)冻存瓶的处理：新购置的塑料冻存瓶应该放人肥皂粉溶液中煮沸 20 分钟，取出后用自来水冲洗 15 遍，再用蒸馏水冲洗 3 遍，烘干，高温蒸汽消毒。2将一瓶处于对数生长期并已长成单层 HeLa 细胞或其他培养细胞的培养瓶从 37培养箱中取出，在无菌环境下倾去培养液，往瓶中加入 0.25的胰蛋白酶 1ml，使其湿润整个瓶底
22、，在室温下消化处理 23 分钟，待单层出现空隙时倒去胰蛋白酶，再加入 4ml 培养液，用吸管将细胞吹打混匀成细胞悬液。3在无菌状态下，将细胞悬液移人无菌的带盖刻度离心管内，加盖。放人离心机中，以 1000r分钟离心 8 分钟。4弃上清液，加入 lml 冻存培养液，吹打混匀成细胞悬液。5吸取少量悬液进行细胞计数，将细胞的浓度用冻存培养液调整到每毫升 300万左右。因为细胞的浓度对冻结和融化时细胞的活力有显著影响，细胞浓度低时失活较显著。6将细胞悬液移人已处理好的 2ml 冻存瓶内，旋紧螺盖。在瓶上标明细胞名称及冻存日期，或者利用无菌的 2ml 注射器将细胞悬液注入到 1ml 无菌安瓿中，注意操作
23、时不要将细胞悬液碰到安瓿颈壁上，然后将安瓿放到酒精喷灯火焰高温区加热封口，注意封口必须完全，否则在解冻时可导致安瓿的爆炸。封完口后在安瓿上做好标记。7将冻干瓶或安瓿装入小布袋中，用棉线扎紧，挂上标签，然后放入 4冰箱中处理 2 小时。8从冰箱中取出布袋，悬吊于液氮罐口内的气相液氮中放置 2 小时，然后将装有冻存瓶或安瓿的布袋移人液氮罐的吊筒内，迅速浸入液氮(196)中。【注意事项】(1)要做好冻存记录(如细胞名称、日期、罐中位置等)。(2)操作时应戴手套，以免皮肤接触液氮而冻伤。(3)液氮容器(罐)应有专人负责，要定期补充液氮。(4)在对安瓿瓶口进行熔封时，要用一镊子夹住安瓿颈以避免安瓿内细胞悬液的温度升高。(5)检查安瓿是否封严，可将其浸入美蓝液中，如果有美蓝渗入安瓿则没封好，应重新熔封。这一点应特别注意，因为安瓿如熔封不完全，在冻存过程中液氮可进入安瓿中，取出时安瓿内温度上升可导致液氮急速气化而爆炸。flower2008-06-26 16:06:32 举报(二)冻存细胞的复苏 1戴好防护眼镜和口罩(最好是面罩)，从液氮罐中迅速取出所需的冻存瓶或安瓿立即投入到盛有 37温水的有盖容器中，同时用手快速摇动冻存瓶或安瓿使所含细胞悬液迅速融比，整个过程要求在 20-60 秒内完成，使细胞能快速通过对细胞特别有害的50O温区。
