1、质粒提取常见问题与解析1.溶液 I溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1,4 糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8时,溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA:(1)螯合 Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用(DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA 的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2.溶液 II-NaOH-SDS 液:NaOH:核酸在 pH 大于 5,小于 9 的溶液中,是稳定的。但当
2、 pH12或 pH3 时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的NaOH 浓度为 0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的 pH 就高达 12.6,因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。SDS:SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase 去除 RNA 时)受到干扰。3.溶液 III-
3、3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:NaAc 的水溶液呈碱性,为了调节 pH 至 4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液,调回 pH 至中性,使变性的质粒 DNA 能够复性,并能稳定存在。而高盐的 3mol/L NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA 、RNA 以及 SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与 SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。4.为什么用无水乙醇沉淀 DNA ?用无水乙醇沉
4、淀 DNA ,这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对 DNA 很安全,因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去 DNA 周围的水分子,使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中,是加 2倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合,其乙醇的最终含量占 67%左右。因而也可改用 95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比 95%乙醇昂贵)。但是加 95%的乙醇使总体积增大,而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解,因而 DNA 损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初
5、次沉淀 DNA 时可用 95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA 。一般在室温下放置 15-30 分钟即可。5.在用乙醇沉淀 DNA 时,为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.10.25mol/L?在 pH 为 8 左右的溶液中,DNA 分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc 或 NaCl,使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷,减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合,这样就造成DNA 沉淀不完全,当加入
6、的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的 DNA 中,由于过多的盐杂质存在,影响 DNA 的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理?加进去的 RNase 本身是一种蛋白质,为了纯化 DNA ,又必须去除之,加 SDS 可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀,再加 KAc 使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀,去除 RNase。在溶液中,有人以 KAc 代替 NaAc,也可以收到较好效果。7.为什么在保存或抽提 DNA 过程中,一般采用 TE 缓冲液?在基
7、因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作 DNA 的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2+产生Ca3(PO4)2 沉淀;在 DNA 反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用 Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是 TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存 DNA 时,大都采用 Tris-HCl 系统,而 TE 缓冲液中的 EDTA 更能稳定 DNA 的活性。8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀 DNA ?采用 PEG(6000)沉淀 DNA ,大小不同的 DNA 分子所用的 PEG 的浓度也不同,PEG 的浓度低,选择性沉淀 DNA 分子量大,大分子所需 PEG的浓度只需 1%左右,小分子所需 PEG 浓度高达 20%。本实验选择性沉淀 4.3kb 的 pBR322 质粒 DNA ,每毫升加入 0.4 毫升的 30% PEG,其最终 PEG 浓度为 12%。PEG 选择性沉淀 DNA 的分辨率大约 100bp。
