1、酶活测定的方法测定酶活1. MDA 的测定【原理】丙二醛在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲恶唑 2,4-二酮） ，其最大吸收波长在 532nm。但是测定植物组织中MDA 时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与 TBA 显色反应产物的最大吸收波长在 450nm，532nm 处也有吸收。植物遭受胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中 MDA-TBA 反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。【试剂】0.5% 10%TBA TCA（1） 、0.5%硫代巴比妥酸（TBA ）：称取硫代巴比妥酸，先加少量氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用 1
2、0%的三氯乙酸定容。（2） 、10%三氯乙酸（TCA）： 10g 三氯乙酸，蒸馏水定容至 100ml。【实验步骤】称取剪碎试材 0.15g，加入 3 mL 10% TCA（三氯乙酸） ，可多次加入4000 r/min 离心 15min吸取上清液 3mL（对照加 2mL 蒸馏水） ，加入 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液1mL，混匀，将混合物于沸水浴中反应 15min，迅速在冷水中冷却。取上清液测定 450532 和 600 nm 波长下的消光度。按下式直接计算得植物样品提取液中 MDA 的浓度。计算丙二醛含量C=6.45（A532-A600）0.56A450单位：mol /L2. 超氧歧化
3、酶(SOD)的测定【原理】SOD 活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定。氮蓝四唑(NBT)在光下被 O2。- 还原为蓝甲替，该物质在 560nm 处有最大的吸收峰。SOD 能通过降低 O2。- 的量而抑制 NBT 的光还原过程，使的蓝甲替量降低，其降低程度与酶活性有关。以每小时抑制氮蓝四唑还原反应 50%的每克鲜重所含的酶量为一个活性单位。【试剂】0.05mol/LPBS 反应介质PH=7.8（1） 、0.05mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8（2） 、反应介质：NBT 750mol/LEDTA 0.1mmol/L蛋氨酸 130mmol/L核黄素 20mol/L磷酸缓冲液 0.05m
4、ol/L（3） 、750mol/L NBT 溶液：称取 0.06133g NBT，用 0.05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液溶解并定容至 100ml,避光保存,现配现用。（4） 、0.1mmol/L EDTA：称取 0.0292g EDTA，用 0.05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液溶解并定容至 100ml。（5） 、130mmol/L 甲硫氨酸（ Met）：称取 1.939g Met，用磷酸缓冲液溶解并定容至100ml，现配现用。（6） 、20mol/L 核黄素：20mol/L 核黄素溶液：取 0.0075g, 用 0.05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液定容至 100ml，用时再
5、稀释 10 倍，避光保存，现配现用 。【步骤】粗酶液提取：取植物材料 0.1g（材料重量记录） ，用预冷的 PBS 在预冷的研钵中研磨，加入 2mL 含有 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (pH =7.8)，分次加入 PBS，匀浆液在低温离心机(4 )中经 10000 g 离心 40 min。上清液用于测定（样品液总体积记录） 。取透明度高的试管 3 支，2 支为对照管，1 支为测定管。试剂 1 2 3反应介质 ml 4 4 4酶提取液 l 100 100 100磷酸缓冲液 ml 0 0备注 待测样品 空白 无酶反应液（对 照）2 号管用黑纸包上，比色时作空白对照，与其余 2 支管一起放在荧光
6、灯下，光强60mol/m2s，照光 30min，然后用黑布罩上。以不照光的对照管作空白，分别测定其它各管的吸光度，每个处理重复 3 次。计算SOD 总活力 = 105.VFWATSA0 对照光的吸光值AS 样品管的吸光值VT 样液总体积 mlV1 测定时样品用量 mlFW 样重 g3. 过氧化物酶(POD)的测定【原理】POD 活性采用愈创木酚法测定。酶活性以每克鲜重样品 1 min 内氧化愈创木酚的微克数为一个酶活性单位。【试剂】30% 0.1mol/L 愈创木酚 H2O2 PBS pH=6.01、愈创木酚：将固体愈创木酚加热溶解后，取需要的量配置成反应混合液。2、100mmol/L 磷酸缓
7、冲液 PH=6.0（预冷）3、反应混和液： 100mmol/L 磷酸缓冲液 100mL，加入愈创木酚 56L， 磁力搅拌器加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，冰箱保存备用。要用时，加入 30%H2O238L，混和均匀，现配现用。【实验步骤】酶液的提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织 0.1g（称重）置研钵中，加入 2ml 4下预冷的 pH6.0 磷酸缓冲液，分次加入、和少量石英砂研磨成匀浆后，混合均匀将量瓶置 5冰箱中静置 10min，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液（记录体积） 。5下保存备用。【方法】：比色杯 2 只反应混和液（ml） P
8、BS（ml） 酶液（ml）校零对照比色杯 3 1 测定比色杯 3 1注：稀释 2.5 倍（0.4ml 酶液+0.6ml PBS） 。充分混合后，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量 470 nm 吸光度值，每隔30 秒读数一次，连续读数 5 次，共 90s，每个处理重复 3 次。【计算方法】以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小。即以A 470/ming（鲜重）表示。也可以用每分钟内 A 470变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位 （U）表示。过氧化物酶活性U/(g FW min)= 式中：A 470反应时间内吸光度的变化；FW植物鲜重(g)；Vt提取酶液总体积（ml） ；Vs测定时取用酶液体积（ml） ；t 反应时间（min） ；A470Vt稀释倍数FWVs0.01t
