1、1实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。材料：微孔滤膜(直径 25 cm)：孔径为 0.22m、微孔滤膜(直径 90 cm)：孔径为 0.22 m、过滤器(直径25 cm)。仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶） 、移液枪、10 毫升试管、10 毫升离心管、巴氏吸管、5 毫升（或 10 毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如 Hanks 液、PBS 等)。
2、 2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、 0.12gKH2PO4 溶于 1000 mL 双蒸水，高压灭菌，4保存。 （准备试剂瓶）灭菌方法： 高压灭菌。2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒 4 个，三角瓶 2 个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球 3 瓶，吸耳球 3 个，吸量管 10 毫升和 5 毫升各 5 根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有 NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加
3、的，如 NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约 500mL 双蒸水。 2）在室温（20到30）的水中加入干粉培养基。 3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。 4）完全溶解之后，1 袋 1L 粉状 DMEM 加 3.7g NaHCO3，1mmoLL 丙酮酸钠，即 0.11g/L，添加双抗。 5）用双蒸水定容到 1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 6）通过缓慢搅拌加入 1N NaOH 或 1N HCL 调节 pH 值培养基在过滤前要保持密封。 7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签， 4保存备用。灭菌方法：
4、 高压灭菌。3）胰蛋白酶-EDTA 消化液胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋白酶（1:250）粉末 0.25g 置烧杯中，溶于 100mL PBS，搅拌混匀，置室温 4 小时并不断搅拌振荡，过滤除菌。 （若配制 400 mL 则应称取 1g 胰蛋白酶）灭菌方法：过滤除菌。EDTA 溶液配制： 0.2g EDTA 用 400mL PBS 溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 4冰箱保存。灭菌方法：高压蒸汽灭菌。胰蛋白酶与 EDTA 按 1：1 混合后分装，4冰箱保存。24）抗生素液双抗（青霉素、链霉素）各 1 克，溶于 100mL 纯水，过滤除菌，分装，4冰箱保存。使用前 1：100 稀释。灭菌方法：过滤
5、除菌。3、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。操作方法：2 清洗 1）新玻璃器皿的清洗 2）使用过的玻璃器皿的清洗 3）胶塞的处理 3 消毒 1）物理消毒法 (2)干热灭菌 (4) 过滤除菌 （5）煮沸消毒 急 2）化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：(1) 70( 或 75)酒精 (2) 0.1新洁尔灭(3) 来苏儿水(煤酚皂溶液) (4) 0.5%过氧乙酸(5) 乳酸蒸气 (6) 37%甲醛加高锰酸钾 (7)甲醛消毒方法 注意事项1、清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗 10-15 次。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗
6、。2、干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过 100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至 100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。3、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干。4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂均不能高压。需要长期保存的血清必须储存于-20-80 低温冰箱中。4冰箱中保存时间切勿超过 1 个月。血清在冻入低温冰箱前，不要装得太满，必须预留一定体积空间， （其他溶液冻存也是如此） 。一般厂商提供的血清无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤。血清解冻需采用逐步解冻法，切勿直接将血清从-20进
7、入 37解冻。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀，使温度与成分均一，待全部溶解后再分装。5、滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜，包好，经高压灭菌后才能使用。过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好，去除压力后针筒会反弹即为完好无损。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧待高压灭菌之后，再拧紧使用。 6、使用化学消毒法时，配制 75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。7、培养基过滤器过滤除菌注意事项：(1) 细胞培养
8、用水一般为三蒸水或超纯水，医药生产上一般为注射用水。 (2) 建议尽量选择与所用量相匹3配的包装一次使用。(3) 溶解干粉培养基时先加入终体积 90%95% 的培养用水，添加剂加完后再定容。(4) 如需添加的组分较多时，某一组分完全溶解后，再添加另一组分。(5) 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠。(6) 所有成分完全溶解后，培养基应立即过滤或高压除菌。(7)在过滤前，可将 pH 调至比所需值低 0.1-0.2 个单位。(8) 在细胞培养过程中，建议不加或加少量的抗生素，如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。(9) 建议用 1N HCl 或 1N NaOH 来调节培养基的 pH。8、
9、物品放进饭盒后要贴好标签，还需要用棉布或牛皮纸包好再贴上标签。在标签处包扎好。容器，包括装 PBS 的玻璃瓶，瓶口要拧松，不能紧，瓶口包扎牛皮纸，灭菌后立刻拧紧瓶盖，然后再取出，冷却后放入冰箱。注意检测标签是否脱落。9、根据每个实验的要求，准备好所需物品，一并放入超净台内。实验器材准备的数量要大于实际使用数，瓶盖要大于瓶数。要配备至少三套器械（一套使用，一套备用，一套清洗灭菌） ，循环使用。10、玻璃瓶、移液管要封闭包扎使用端，标记手持端。实验二 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养1、如何进行鸡胚胎成纤维细胞的原代培养。实验进行前，准备好相关器材，无菌室及超净工作台以紫外灯照射灭菌 30-60 分钟（
10、溶液同时 37预热） ，然后开启通风 10 分钟后，才开始实验操作。实验用品以 75% 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域酒精灯火焰旁进行。1、取 9-10 日龄的鸡胚，用酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头尾、四肢及内脏；2、胚体用含双抗 PBS 冲洗 2-3 次，切成 1-2mm3 的小块，然后转入容积适量大小的离心管；3、按每个鸡胚加入大约 5mL 的胰酶消化液，在室温（或 37）下消化 10 min，吸管（或枪头）不停吹打；4、加入含小牛血清培养液终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；5、收集到的细胞悬液经 100 目
11、过滤筛过滤，1200 转离心 5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；6、细胞沉淀用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液重新悬浮；7、以 5105 个/mL 的密度溶液 3.4ml 接种到培养瓶中（大约 20-30mL 细胞液/鸡胚 0.6ml） ，观察细胞形态（绘图） ，将瓶盖微松，于 37、5% CO2 浓度、饱和湿度条件下培养。48、经过 1 天的培养。2、原代培养时如何从组织分离细胞?收集到的细胞悬液经 100 目过滤筛过滤，1200 转离心 5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧
12、开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；6、细胞沉淀用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液重新悬浮；3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。实验三：培养细胞的形态观察及活率检测1 简述培养细胞的形态观察方法及注意事项。(一)培养细胞的形态观察1、将细胞培养瓶从二氧化碳培养箱中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。2、打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。3、调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节
13、器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是 20X 物镜 （绘图） 。(二) 观察细胞体外培养状况细胞培养 24h 后，即可进行观察，观察的重点如下：A首先要观察培养细胞是否污染（观察阳性对照样品） 。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。B观察培养基颜色变化及细胞是否生长。C如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。D观察完毕，可用台盼蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。2、简述台盼兰染色和伊红染色检测细胞活率的原理及操作方法。台盼兰染色原理：由于培养基内有 pH 指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时
14、，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。伊红染色检测细胞活率的原理：贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。5操作方法：（四）台盼兰染色1） 配制 0.
15、2(W/V)台盼兰水溶液（溶于 PBS，加热使之完全溶解，用滤纸或纱布过滤除渣，装入瓶内室温保存） ，及 4.25 %(W/V) Nacl 溶液；2） 测定前，取 4 份 0.2台盼兰与 1 份盐水混合；3） 取台盼兰溶液，另入到等量细胞悬中(细胞浓度 2-5106 细胞/ mL)混匀；4） 将细胞悬液加入血球计数板中，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。分别计数末染色的细胞数(活细胞)及染色的(死细胞)细胞数。细胞计数 200 个以上， （绘图） 。5）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100 %。（五）伊红 Y 染色1） 配制 0.2(W/V，
16、溶于 PBS)伊红 Y 水溶液；2） 取 0.1mL 细胞液悬(细胞浓度 2-5106 细胞/ mL)，加入等量伊红 Y 溶液混匀；3）2 min 后将细胞悬液加入血球计数板中，镜检、计数。死细胞染成桃红色，活细胞不着色 （绘图） 。细胞计数 200 个以上。 ， （绘图）4）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100。3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。放大的计数室按下式进行细胞浓度的计数：注 4 大格中的每一大格体积为 0.1mm3。1mL=l，0000 大格，因此，1 大格细胞数104=细胞数mL。注 染色标本在 15 分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞
17、染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养61、简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部 （绘图） ，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1、完全培养基配制:DMEM 液 90；小牛血清 10；双抗(1 万单位mL) 加至约 100 单位mL；2、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内；3、
18、从培养箱内取出细胞，取出细胞时要旋紧瓶盖，再在镜下观察细胞。用酒精棉球擦拭后放入超净台内；4、在酒精灯旁打开瓶塞，在酒精灯上烧口消毒，吸出原培养液，然后用 PBS 清洗细胞 2 次，尽量除去残余的血清；5、25 mL 培养瓶中加入 0.2 mL 的消化液进行消化，以盖满细胞为宜，置于室温或放置于培养箱内，停留1-2min 后，不停摇晃培养瓶。消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形，细胞之间不再连接成片为度；6、吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；7、收集细胞悬液，1200-1500
19、 转离心 5 min，去上清；8、用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活率和密度，以 5105 个/mL 密度（1：3）接种到培养瓶中，在瓶侧壁做好标记；8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度；适当旋松瓶盖，于 37、5% CO2 浓度、饱和湿度条件下培养；9、4 小时后及第二天观察细胞生长情况。图 4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程五、注意事项1、严格无菌操作，作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开，不同液体不要共用吸管。2、所有溶液最好 37预热。3、掌握好消化程度。4、正确摆放使用
20、的用具，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。2、细胞传代培养获得成功的关键要素是什么?在做传代细胞培养之前，将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，才能进行传代培养。传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。73、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。实验二 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养（大约 20-30mL 细胞液/鸡胚） ，观察细胞形态（绘图） ，实验三：培养细胞的形态观察及活率检测在观察时，最经常使用的是 20X 物镜（绘图） 。（观察阳性对照样品， （绘图） ） 。细胞计数 200 个以上， （绘图）
21、 。活细胞不着色， （绘图） 。细胞计数 200 个以上。实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部（绘图） ，8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度（绘图） ； 9、4 小时后及第二天观察细胞生长情况（绘图） 。图 4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程啤酒发酵实验实验目的：1. 学习酵母菌种的扩大培养方法，为实验室啤酒发酵准备菌种。实验原理：1 在进行啤酒发酵之前，必须准备好足够量的发酵菌种。在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的 10%，因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养。扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是
22、使酵母由最适生长温度（28）逐步适应为发酵温度（10） 。.2 啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦醪过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程。啤酒发酵是纯种发酵，必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。3.麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的价格相对较高，再加上发酵过程中需要较多的糖，实验器材：恒温培养箱，生化培养箱，显微镜、粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、发酵罐、制冷机、板8式换热器、糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅、带冷却装置的发酵罐（50L，100L ） 、 。实验步骤：一.啤酒酵母的扩大培养28，2 天 菌种扩大: 麦汁斜面菌种麦汁平板 镜检，挑单菌落 3
23、个，接种50mL 麦汁试管（或三角瓶）20，2 天550mL 麦汁三角瓶15，2 天计数备用。每天摇动 3 次 每天摇动 3 次1 培养基的制备取协定法制备的麦芽汁滤液（约 400 mL） ，加水定容至约 600 mL，取 50 mL 装入 250 mL 三角瓶中，另550 mL 至 1000 mL 三角瓶中，包上瓶口布后，0.05 Mpa 灭菌 30 分钟。2 菌种扩大培养按上面流程进行菌种的扩大培养（斜面活化菌种由教师提供） 。注意无菌操作。五、注意事项：灭菌后的培养基会有不少沉淀，这不影响酵母菌的繁殖。若要减少沉淀，可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。二、小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐的空消
24、1. 熟悉各项设备；清洗各项设备；在回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中通入蒸汽，消毒 30 分钟。待各项设备使用结束后，应及时进行清洗灭菌。三、麦芽汁的制备1.麦芽粉碎用谷物粉碎机粉碎，使粗细比例控制在 1：2.5，同时使表皮破而不碎。必要时可稍稍回潮后在粉碎。2.糖化采用浸出糖化法实验台称 600g 麦芽加入 3000ml 水，分入四个烧杯中于水浴锅上加热，使水浴锅中的液面高于烧杯中的液面。糖化流程：3537 ，保温 30min5052 60min65 30min（碘液反应完全） 7678 送入漏斗中进行过滤。3.麦汁过滤：用 46 层纱布进行过滤，前 1L 滤液收集返回漏斗中重新过滤，其余正
25、常过滤。9把糟用 2L 的 70 度的水 冲洗出来，充分利用原料。（过滤目的：尽快把麦汁和麦槽分开，以得到清凉和较高收率的麦汁，避免影响半成品麦芽汁的色香味。）4.麦汁煮沸：收集全部滤液，加热煮沸后加入 5g 酒花，继续煮沸 11.5h。其间要经常搅拌。停火后，沿着锅壁顺着一个方向搅拌，锅底中间会出现沉淀物。静置，把热麦汁趁热缓缓倒入灭过菌的封口容器（大的带盖子的） ，尽量减少沉淀物进入。目的：通常采用传统的间歇常压煮沸法。煮沸时间一般为 70-90 分钟。 ）5.麦汁冷却。在麦汁冷却到室温后加入啤酒酵母，这个过程容易染菌，须在酒精灯火焰保护下加入6.设备清洗由于麦芽汁营养丰富，各项设备及管阀件（包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器）使用完毕后，应及时用洗涤液和清水清洗，并蒸汽杀菌。7.主发酵10 发酵 56d。发酵结束制成嫩啤酒。观察主发酵过程中的变化，并且做好实验记录。8.后发酵装瓶后置于冰箱中发酵 7d。实验结果
