1、凯氏定氮法在化学分析中的应用摘要：蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的东西都含有不同类型的蛋白质。蛋白质又是食品的重要组成之一，也是食品中的营养素指标。它是复杂的含氮有机化合物，其溶液是典型的胶体分散体系，有两性氨基酸以肽键相互连接而成。蛋白质可以用酶、酸或碱水解，最终水解产物为氨基酸，其中赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸在人体内不能合成，称为必须氨基酸 【1】 。他们对人体起很重要的生理功能作用。在国家标准中，对蛋白质的测定一般采用凯氏定氮法。下面对蛋白质、凯氏定氮法以及粮油中粗蛋白的测定进行说明。关键词：凯氏定氮法、粗蛋白、粮油、测试蛋白质：蛋白质为人体补
2、充蛋白质，是人体不可缺少的重要营养素，是唯一可帮助身体形成新组织的营养素，可制造肌肉、血液、皮肤和各种身体器官，蛋白质约占人体体重的 20%。最主要具有以下多种功效：1.提供多种氨基酸，帮助身体制造新的组织以替代老化组织抗衰老。2.通过增加血红蛋白和胶原蛋白改善皮肤弹性和透明度红润度。3.调节血液血红蛋白向细胞输送氧和各种营养素，促进机体生长。4.调节体内水分的平衡。5.为免疫系统制造对抗细菌和感染的免疫球蛋白和荷尔蒙。6.在体内制造各种蛋白酶，有助将食物转化为能量，恢复疲劳。7.均衡提高人体所需的八种必需氨基酸。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。故各种不同的蛋白质含氮量也不同。一般蛋白
3、质含氮量为 16%，即一份氮相当于 6.25 份蛋白质。此数值（6.25）称为蛋白质换算系数 【2】 。不同种类的粮食油料其蛋白质换算系数也有所不同，如小麦为 5.70，谷物及豆类为 6.25。在国家标准中粮食油料中粗蛋白质的测定采用凯氏半微量定氮法。该法是1883 年由丹麦化学家凯道尔（Johan、kjedahl） 【3】 创立的。该方法适于以测定任何形态（固体、液体）的样品。而且具有很高的准确度和精密度。因此在食品分析、饲料分析、粮食品质分析及种子品质鉴定和生化研究工作中得到广泛应用。前景：蛋白质是食品中重要营养指标 【4】 ，各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同。一般说来，动物性食品的蛋
4、白质含量高于植物性食品。测定食品中蛋白质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提到食品质量具有重要意义。凯氏定氮法：凯氏定氮法是测定含氮的有机物质（如面粉、谷物、肥料、生物碱、肉类中的蛋白质、土壤、饲料以及合成药物等）中氮含量的重要方法。测定时将有机试样与 H2SO4共煮进行消化分解，为提高沸点促进分解加入 K2SO4，通常还加入 CuSO4（或汞盐）作催化剂，以提高消化效率。消化时有机物中的 C转变为 CO2，H 转变为 H2O，而 N 则转变成 NH3，H 2SO4被还原成 SO2和 H2O,NH3与过量的 H2SO4结合成（NH 4） 2SO4或 N
5、H4HSO4保留在溶液中，消化液用过量的浓NaOH 处理后，再用蒸馏法测定 NH4+。对于含有硝基、亚硝基或偶氮基等的某些有机化合物，在消化前先用还原剂如亚铁盐、硫代硫酸盐及葡萄糖等进行处理，使氮定量转化为铵离子。目前在我国的国家标准（GB）及国际标准方法中仍却仍凯氏定氮法为标准的检验有机化合物中的含氮量的方法。优点：1.可用于所有食品的蛋白质分析，2.操作相对简单。3.试验费用低。4.结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。5.有改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微凉的蛋白质缺点：1.最终测定的是总有机物氮，而不只是蛋白质氮 2.试验时间太长（至少需要 2 小时才能完成）3.精度差、精度低
6、于双缩脲法 4.所有试剂有腐蚀性粗蛋白含量的测定1.测定原理凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解。其中的氮元素反应生成铵盐，铵盐再与浓硫酸作用，放出的氮气经硼酸吸收后，用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氮，计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得到蛋白质的含量。（1）消化 蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中的碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成氨，并与硫酸化合形成硫酸铵残留于消化液中。有机物（含 N、C、H、O、P、S 等元素）+H 2SO4加热 -CO2+(NH 4)2SO4+-H3PO4+SO2+SO 3由于上述反应进行很慢，消化需要很长的时间，加入
7、催化剂可加速反应，硫酸铜是常用的催化剂，硫酸钾能提高硫酸的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化，促进有机物分解的作用。（2）蒸馏 消化所得的硫酸铵加碱蒸馏，氨又被释放出来。 （NH 4）2SO4+2NaOH=2NH3H2O+Na2SO4NH3H2O=NH3+H 2O(3) 吸收与滴定 生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示剂颜色变化，再用盐酸滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，用去盐酸的物质的量即相当于样品中氮的物质的量。2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3将含氮量乘以蛋白质换算系数，即为粗蛋白质含量。2
8、.仪器与用具50mL 凯氏烧瓶；1000mL 园底烧瓶；万用电炉；100mL 锥形烧瓶；5mL 微量滴定管，刻度 0.01mL；50mL 容量瓶；5mL 移液管；10mL 量筒；洗耳球；凯氏微量蒸馏装置。3. 试剂（1） 浓硫酸+过氧化氢+水混合液 在 100mL 水中缓慢加入浓硫酸 200mL，冷却后加入 30%过氧化氢 300mL，混匀备用。此液存放阴凉处可保存一个月。（2） 混合催化剂 10g 硫酸铜（CuSO 4.5H2O）,100g 硫酸钾，0.2g 硒粉，在研钵中研细，通过孔径 0.45mm 筛，混匀后备用。（3） 40g/100mL 氢氧化钠溶液。（4） 2%硼酸溶液。（5） 0
9、.01mol/L HCl 溶液（6） 甲基红乙醇溶液 称取 0.1g 甲基红置于研钵中，加入少许 95%乙醇。（7） 次甲基红乙醇溶液 称取 0.1g 次甲基蓝溶于 80mL95%乙醇中。临用时将以上两液按 2+1 比例混合即成。在酸域呈紫红色，Ph5.5 时无色，在碱域呈绿色。4.操作方法（1）消化 按照含有 10-30mg 粗蛋白计算试样用量，一般可称取试样 0.2-0.3g（W，精确到 0.0001g） ，用蜡光纸卷着倒入 50mL 凯氏烧瓶中，加混合指示剂 1g，同时加入硫酸+过氧化氢+水混合液 3-5mL，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，勿使瓶中泡沫
10、超过瓶肚的 2/3，待泡沫减少和烟雾变白后在增加温度保持微沸。消化到溶液呈浅绿色的透明状时，再继续加热沸腾 10min，取出待消化液冷却至室温后，加水 10-20mL，再待溶液温度降到室温后，干净地转入 50mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀备用。（2） 蒸馏与吸收 凯氏蒸馏装置如图所示。（1-蒸馏瓶；2-冷凝管；3-三角瓶；4-回流瓶；5-漏斗；6-活塞；7-簧夹；8-烧瓶）它是由蒸汽发生器，反应瓶及冷凝管等组成。按照图进行安装和蒸馏、吸收。在烧瓶 8（容量 1000mL）内加入蒸馏水 400mL 和少量碎玻璃片，加 5 滴混合指示剂，加几滴酸液，使水呈紫红色，盖紧瓶塞，连接 4、1、2
11、并检查有无漏气。量取 30mL2%硼酸溶液，注入（100mL）三角瓶 3 内，作为承接器，加混合指示剂 1-2 滴（溶液呈灰紫红色） ，置于冷凝管 2 下面，使管尖端插入硼酸溶液 1cm 深处，用 5mL 移液管吸取 5mL（V）试样稀释液，由漏斗 5 注入蒸馏瓶 1 内，再倒入蒸馏水 10mL 冲洗漏斗 5，接着量取 40g/100mLNaOH 溶液1mL，由漏斗 5 注入蒸馏瓶 1 内，再用 2-5mL 水冲洗漏斗 5，旋紧活塞，此时蒸馏瓶 1 内溶液总体积应不超过容积的一半。打开电炉加热烧瓶 8，打开簧夹 7，关闭活塞 6，使沸腾蒸汽通过 4 进入 1，再由 1 进入 2 而流入 3，待
12、 3 内的溶液呈绿色时，开始记录时间，经 2-3min 后，将 3 放低，使冷凝管 2 下端离开液面，继续蒸馏 1min，然后用少量无 CO2蒸馏水冲洗冷凝管 2 下端，蒸馏即告结束。蒸馏结束后，旋紧簧夹 7，断绝蒸汽，这时由于管 4 内蒸汽压立即降低，所以瓶 1 内的液体则全部吸入回流管 4 内，然后打开漏斗 5 下簧夹，注入蒸馏水 40-50mL 于瓶 1 内，关闭 5 下簧夹，打开簧夹 7，通入蒸汽加热洗涤蒸馏瓶 1，再断绝蒸汽，使洗涤液回流至回流管 4 内，打开活塞夹 6，将回流管 4中废液弃去，关闭簧夹 7，为下次蒸馏做好准备。（3） 滴定 用 0.01mol/L HCl 标准溶液滴
13、定三角瓶 3 中的吸收液至出现淡紫红色为止。记录所消耗标准盐酸的毫升数。空白试验除不加试样外，消化、蒸馏和吸收、滴定操作与样品相同。5. 结果计算粗蛋白质的干基含量按公式计算：粗蛋白质（干基%）=（V 1-V0）N*14*P*50/V*10000/W(100-M)式中 V蒸馏时取用稀释的消化液体积，mL；V1实验用去的盐酸溶液体积，mL；V0空白试验用去的盐酸溶液体积，mL；NHCl 标准溶液的浓度，mol/L；14与 0.01mL 盐酸标准溶液【c(HCl)=1.000mol/L】相当的氮的质量，mg；P蛋白质换算系数（小麦 5.7，鼓舞及豆类 6.25） ；W试样质量，mg；M试样水分百分
14、率，%。双试验结果允许差：粗蛋白质含量在 15.0%以下时，不超过 0.2%；粗蛋白质含量在 15.1%以上时，不超过 0.4%；求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位。6. 附注（1） 消化过程中，若硫酸损失过多时，可酌量补加硫酸，勿使瓶内干涸。（2） 消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏，否则应保存消化液，临用时加水稀释。（3） 蒸馏时加入的碱液必须过量。（4） 也可使用由 0.2%甲基红乙醇溶液 1 份和 0.2%溴甲酚绿乙醇溶液 5 份配制的混合指示剂（临用时混合） ，终点为灰红色。参考文献【1】 汪东风。食品质量与安全试验技术。北京：中国轻工业出版社。【2】 王肇庆。粮油食品品质分析。北京：中国轻工业出版社，1994.【3】 穆华荣。食品分析。第二版。北京：化学工业出版社，2009.【4】 吴永宁。现代食品安全科学。北京：化学工业出版社，2003.
