1、DGGE 的基本原理DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis 变性梯度凝胶电泳) 不是将分子量不同的 DNA 分开,而是通过 PAGE(聚丙烯酰胺) 凝胶中变性剂浓度梯度的不同 ,将序列不同的 DNA 分开。该方法的原理是根据 DNA 的解链特性, 不同碱基组成的 DNA 双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链 DNA 在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与 DNA 变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的 DNA 发生解链变性,导致电泳迁移速率 降低。由于泳动受阻 DNA 分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同
2、 DNA 分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同, DGGE 可分为:垂直 DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围; 平行 DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的 DNA 片段的检测。DGGE 实验 一1. 制胶：使用梯度胶制备装置，分别制备 30%和 60%的变性胶。DGGE 制胶参数制胶 30%变性胶的配置 20（ml） 60%变性胶的配置 20（ml）40%丙烯酰胺（Bis-Acr） 5ml 5ml50TAE 400ul 400ulFormamide 去离子甲酰胺 2.4ml 4.8ml尿素（urea） 2.
3、52g 5.04gDdH2O 定容至 20ml 定容至 20ml10%AP(APS) 100ul 100ul最后加（几分钟内凝固） TEMED 20ul 20ul试剂配方：40%丙烯酰胺（Bis-Acr）：Acrylamide 丙烯酰胺 38.93g Bis-acylamide 双丙烯酰胺 1.07g蒸馏水定容至 100ml50TAE：TrisBase 242.0g冰醋酸 57.1mlEDTA o.5M PH 8.0 100ml去离子水定容至 1000ml。10%APS； Ammonium persulfate 过硫酸铵 0.1g， 蒸馏水定容至1.0ml.2. 灌胶具体步骤见设备说明3. 点
4、样缓冲液加热至 60后准备点样。将 45 微升的 PCR 产物和 5 微升 6loading buffer 混匀后加入上样孔。若 PCR 产物亮度一般，可加 90 微升 PCR 产物和 10 微升 6loading buffer 混合液。 （微量进样器与色谱进样器相似）4. 电泳在 1TAE 缓冲液中（可加 140m l50TAE 加蒸馏水至 7L） ，只开 heat，不开 pump，先在 200V 电压下，10min，是样品快速跑出泳道，以免把 DNA 吹出，然后打开pump，85V，60，电泳 14h.2012-6-21 晴天二、变性梯度凝胶电泳胶制备1. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似“
5、三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为 15.5cm，短的那根长 9cm。将短的那根与 Y 形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在 30ml 的注射器上。3. 在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度 ，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到 1
6、4.5。5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。三. 微藻生物群落多样性研究变性梯度凝胶电泳技术（denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)是一种重要的分子多态性技术，在物种鉴定及浮游生物群落多样性研究方面有着广泛的应用。可以对多个样品同时进行分析，具有快速、简便、直观结果可靠、重现性好等特点，因此可以对环境中的微生物在时间和空间上的变化进行监测11。 四. 变性梯度凝胶电泳胶制备121. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己
7、。2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为 15.5cm，短的那根长 9cm。将短的那根与 Y 形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在 30ml 的注射器上。3.在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如 16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到 14.5。5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。配置剂量如下:试剂 35%45%0%变性剂 9.75ml,
8、8.25ml 100%变性剂 5.25ml,6.75mlAPS : 80l,80lTEMED:18l,18l注意在加入 100%变性剂后，在高浓度的丙烯酰胺溶液中加入摇匀的 ER 燃料300l。以便于与低浓度的区分。1. 加完后迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有高浓度的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。2. 通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。3. 分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确!再将注射器
9、的聚丙烯管同 Y 形管相连。4. 轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。5.小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。放入 4冰箱中备用。6.迅速清洗用完的设备。2.2.2.4 电泳过程1. 电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到 60。2. 移去顶部梳子之后，将相关设备和胶移至电泳槽内，使缓冲液高度刚刚没过胶上的加样孔。清洗点样孔。3. 用注射针吸取 40l 样品点样。样品为第一步中获得的 PCR 产物与 2x染色剂 Loadingbuffer 按照 1:1 比例混合而成的。4. 200V,不开 PUMP，电泳 10min5. 开 PUMP，150V，电泳 6h2.2.2.5 染色拍照1. 配置 0.5g/mL 溴化乙锭（EB）,配方为 500mlH2O20mlEB2. 电泳完毕，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。(用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。)然后将盘中的的胶放入配置好的 EB 溶液中染色 30min。3.染色后小心地将凝胶转移到 gel documentation system 中拍照，要尽快操作，否则在紫外光的作用下，很快图像的效果就会降低。4. 用 Quantity One 进行定量分析图像
