1、【转】Western Blot 实战指南：从电泳到定量-1样品制备：变性条件SDS LB 直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB 久煮某些性质会改变）的 1*SDS LB（或者略高 1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常 6 孔板细胞 80%以上密度，需 200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB 都是过量的（因此不一定要严格参考 SDS LB稀释比）；如果 SDS LB 不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现 tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住 tip。这时候常规做法有两种，1. 再煮 5min。常
2、规煮样时间 3-5min，样品过浓时就煮 10min；2. 如果 10min 煮样后，仍然吸不起来，才适当增加 SDS LB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续 WB 的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层）此方法的缺点，SDS LB 煮过的样品如果用来做 IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM
3、KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20g/ml leupeptin, 10g/ml pepstatin A and 10 g/ml aprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用 0.5mM PMSF 替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加 1mM Na3VO4（现加现用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。此方法的优点：NaCl 浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的 IP 等试验。其他 Na 盐浓度的细胞裂解液也
4、很常见，诸如 0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及 0.8-1.2M；0.3M 及以下适合 IP 试验，0.6M 及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的原因是 0.5% NP-40，用于破坏核膜结构；可用到 1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候，比如 50mg 新鲜癌组织，我采用的方法是1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快
5、速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于 WB 检测；如果含量过低，需要用TCA 沉淀富集。理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最佳的实验条件；但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去 WB 会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在 60-46 kDa 之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白（主要是 BSA）浓度过于富集，会非特异性粘
6、附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，采用 SDS LB 裂解细胞制备样品前，通常要用 PBS 洗涤，其目的之一是去除培养基中的 BSA。采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如 AKT 等），还会出现的问题是：1. 即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用 TCA 沉淀富集，再重新溶解。a. TCA 沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要 180 度翻转离心两次。b。重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解
7、，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的 WB 实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦经验之谈，我曾经参与的 cancer cell 文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但 90%的数据是 cell lysis；偶尔用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。样品制备完，应立即低温保存（-20 度短期（几天）；-80 度长期；例外，IP 用样品应直接进行 IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）。SDS LB 煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS 沉淀；SDS 4 度就会沉淀，何况-
8、80 度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDS LB 不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB 本身系统误差有 20%，太细微的差别经常忽略不计。 细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对 WB 结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%
9、胶最底边约 36KDa，10%最底边约 25KDa，12%最底部约 12KDa。8%胶可以跑 300KDa-36KDa 之间的任意蛋白，转膜效率对 WB 结果的的影响都问题不大。12%，180KDa 左右，转膜效率对 WB 结果的影响都问题不大（ 300KDa 蛋白如何，没有尝试过）。电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合 gibco model V16 型，胶宽 20cm）。采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。散热不好，条带出现波浪状。注意事项：
10、1聚丙烯酰胺的 30%母液会降解，要 4 度避光保存。2APS 会失效，10%APS 一般保质期才一个月左右。-20 度分装长期保存。3注意 Tris buff 的 PH 值，以及平时所用的水的 PH 值。PH 值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）4上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS-PAGE 胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多
11、。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是 RNA 的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有 SDS
12、 润滑）。判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。6上样时，不要把 tip 深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。7未加样的孔应添加高浓度 SDS LB 平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20ul 样品（含 5ul 4*SDS LB），可用 8-8.5ul 4*SDS LB 平衡。同理，点 marker 的lane 也要加入同样体积的 LB。LB 若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧 LB 靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用 LB 应一致。LB 应-20
13、 度保存。8增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而 WB 灵敏度是以 10 的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是 IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样 WB 条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。仍以 6 孔板 80%以上汇合度为例，细胞裂解液和 SDS LB 通常都是投入200ul（最少 80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），
14、而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在 5-6ul，最少 2.5ul，最多 10ul，10ul 时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对 WB 结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。9. 不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组 IP 样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为 15ul，刚好+5ul 4*SDS LB 达到常规20ul 上样体积；后者第 8 点提到只上 5ul，同样+5ul SDS LB（比重同，不会互相挤压），最好补加 10ul DDW 使总体积一致。通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔
15、开（空白仅指无蛋白，仍应加入 8-8.5ul 4*SDS LB），这样才能确保每条带都很美观。10. SDS PAGE 胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期 4 度保存。个人习惯为，灌好分离胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。两种方案都可以。所以如果预计次日工作量较大，可以提前灌好 SDS PAGE。样品是否一定需要定量再上样？不是的，这是浪费时间的一个操作。我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。蛋白定量首先需要一个参照系（标准蛋白），参照蛋白通常选择 BSA，也就是说你所谓的定量是对应于 BSA 的
16、浓度的一个参照值。这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响；不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌入。因此你其实默认将所有的蛋白等同于 BSA 在溶液中的折叠状态、光吸收情况下，然后做出的一个相对判断，这就存在一个“系统误差”还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。其次，裂解组织或细胞的时候，那些裂解液中，某些溶剂本身会使 Coomassie G250 或者 Bradford 法（实际也是 Coomassie 染色）显色，尤其是去污剂之类；例如 NP40，就会使 Coomassie 显蓝色，可以完全覆盖掉蛋白与 Coomassie 作用产生的蓝色。因此，如果你的裂解
17、液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是 NP40 颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。【需要说明：我目前只知道 NP40 会这样，因为我们从来不去定量，没有做过更深入的研究。】实际上保证你的内参一致，是从样品制备开始的，上节末尾有提到，不赘述。如果你从制备样品时就注意过定量问题，实际上通常内参差别不会太大。如果真的有差别，通常我们会先跑少量的样品，目的是让 Actin 或 tubulin 更清晰、不会粘连、不会过曝光。从而在第二轮跑正式结果前，根据第一轮的内参的荧光信号做微调，大致能做到相当；最多可能需要第三轮。以上的试验可以精确到 0.1ul 差异（我很多
18、体外生化试验之前的调整酶量就是这样进行，此时根本不可能有足够的蛋白让你去定量）。当然凭曝光强弱调整上样量的前提是，你的WB 技术很稳定，很可靠，这是需要相当多的经验积累，如果你一时掌握不了，可以让经验更丰富的师兄师姐或者导师帮忙。顺便提到，有人问过用 Quantity One 等定量软件对光密度定量后计算差别从而调整上样体积是否可以？不可以。 因为 WB 结果经过多重放大，精确计量只代表相对于对照组的相对比值，与实际比值还是有误差，所以按计算值更改上样量仍会出现偏差。如果非要做定量的话，要注意你的裂解液配方，把每种溶剂都先加入到显色液中尝试一下，避免那些本身会显色的物质出现在你的裂解液中；当然
19、，某些物质的去除可能影响对组织蛋白的提取。所以这是一个两难的问题。转印转印效率对 WB 结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！首先必须澄清的是，很多时候新手会把 WB 结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。有一个简单的例证，Biorad 提供的 3mm 厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的 marker 深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建议少用这种新滤纸做那种含量特别稀少或者转膜非常困难的蛋白）。没有很好的策略可以解决这个新滤纸的问题；尝试过
20、浸泡（会泡烂的）、预电泳（会稍微好点）等等，效果均不理想。通常，最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。每次用完后清水稍微冲洗一下表面盐分（要控制水流；水流太大，纸张会烂掉的），晾干再用；只要没冲烂可以一直反复使用。其次，尽管转膜效率不起决定性作用，但由于 WB 的流程相对较长，所以每个步骤的叠加作用会被级数放大，因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好，因此以下仍会深入探讨如何提高转膜效率。针对提高转膜的效率，个人认为最先应该考虑到的是仪器的选用。这里不是歧视“made in China”，国内的厂家很少注重不断提高自己产品的品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合；但说到转膜仪
21、，能把一个简单的匀场电极做好的还真不多（就我道听途说的，国外厂家为了使电极之间场强更加均匀，那种大块金属板表面是镀过极薄的白金层）；因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。目前，个人使用过的国产电转槽（湿转）唯 Tanon 仿 Biorad 的还可以（算替它们免费打个广告吧，Tanon 仿biorad mini3 型电泳仪，在某些方面（主要是操作）上还优于 Biorad 原装；目前我认为“中国制造”的灵魂就是仿造并超越前者）；半干转仪一律进口，用过Biorad、 amersham 和英国公司的 scieplas。PS：批评一下 Biorad。Biorad 的半干转仪，其硬质塑料外壳会莫名其妙的
22、碎裂（绝非摔裂、磕碰，因为底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除残留盐渍，基本不会移动；即便如此它自然就会碎裂），以致于其核心组件未坏的情况下，因外壳碎裂不得不报废该仪器（其外壳里包裹电源线，外壳碎裂，电源则无法接通，导致仪器报废我们先后买过 3 台都是这样的毛病，其间间隔了 3 年，不能肯定近来 Biorad 有没有改进这个问题；如果没有，我想市场迟早会被其他公司所取代）对这三款产品，Biorad 的外壳有明显的质量缺陷，容易过早报废；amersham 独特的蜂窝式设计确实对转膜效率有所提高，但蜂窝式使得与“三明治”的接触面减少，电转时散热不太好，做大蛋白（半干转仪也可以做大蛋白转膜，效率确实
23、不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用）长时程（3hrs）转膜需要在 4 度冰柜或 cold room 进行；英国的产品，价格较高，公司不太出名国内不一定有代理，但质量和散热都非常好。这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为 150KDa 以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚才提到的 amersham 半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义，何况还可以外加条件弥补；而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义我说过转印效率对 WB 结果不起决定因素。湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转
