1、Bac-to-Bac 表达系统I. pFastBac-X 重组质粒的构建利用分子生物学技术构建所需的 pFastBac 重组质粒,以 DH5 为宿主,进行扩增.(以下以 pFastBac-X 为例进行说明.II. pFastBac-x 重组质粒的转座步骤：1. 制备 LB 琼脂平板。LB 培养液（含 Agar）：胰蛋白冻 10g/l，Nacl 10g/l，酵母提取物 5g/l，Agar 15g/l高压灭菌后，培养基温度下降至 60左右迅速加入下列成分：卡那霉素 50ug/ml庆大霉素 7ug/ml四环素 10ug/mlBluo-gal 100ug/mlIPTG 40ug/ml各成分混匀后，乘热
2、在每块平板中加入约 20ml 培养基，待凝固后放置 37烘箱干燥产生的水汽。2. 取出 DH10BacTM 感受态细胞冰上融解。3. 用移液枪吸取 100ulDH10BacTM 感受态细胞于 1.5ml EP 管。4. 轻轻加入 1ng（约 5ul）重组质粒 X 于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀。5. 冰上放置 30min。6. 42循环水浴静止 45 秒。7. 快速放置冰上 2min。8. 在上述管中加入 900ul S.O.C.培养基。9. 将 EP 管置于 37摇床（225rpm）4h。10. 用 S.O.C.稀释上述细胞至 101、102、103。11. 在每块 LB 培养基中加入
3、上述稀释液 100ul，涂布均匀。12. 37培养 2448h。 （单克隆很小，24h 前很难分辨是否为蓝色克隆）注：1）1、3、4、8、10、11 在超净台内进行。2）用 Xgal 代替 Bluo-gal 会降低颜色浓度。真正的白色克隆在菌落长得较大时还是呈白色，建议在黑色背景下进行挑选。III. 重组 Bacmid DNA 的分离提取（在提取前，可以在含 Bluo-gal 的 LB 琼脂平板上划板进一步确认）溶液配置：溶液：Tris-Hcl(15Mm) 0.119gEDTA (10Mm) 0.187gRnase (100ug/ml) 0.5ml(贮备液 10mg/ml)用纯水溶解并定容至
4、50ml（调 pH8.0）溶液：NaOH 0.2NSDS 1%溶液：醋酸钾（3M） 14.7g 溶解定容至 50ml，pH5.5TE 溶液：1. 挑取白色克隆于 2mlLB 培养基（含 50ug/ml 卡那霉素、7ug/ml 庆大霉素、10ug/ml 四环素） ，37摇床 250300rpm 培养 24h 以上。2. 取 1.5ml 培养物于 1.5mlEP 管中，14000g 离心 1min3. 倒去上清夜，倒立于吸水纸上。然后加入 0.3ml 的溶液用枪头轻轻吹打重悬细胞。4. 加入 0.3ml 溶液，轻轻混匀，室温放置 5min（溶液变清）缓缓加入 0.3ml 溶液，轻轻混匀，形成蛋白及
5、 DNA 沉淀，冰上放置510min。5. 14000g 室温离心 10min，期间另取一 2ml 离心管，加入 800ul 异丙醇。6. 轻轻把上清液转入含异丙醇的离心管，避免把白色沉淀带入。轻轻倒转离心管数次。冰上放置 5min（该过程可放在20过夜） 。7. 室温离心 15min8. 去上清，倒置离心管于吸水纸上，然后加入 70乙醇洗涤沉淀数次，14000g室温离心 5min9. 尽可能弃去上清，小心操作，勿使沉淀弃去。10. 使沉淀在空气中自然挥干，510min。加 40ulTE 溶液，轻敲管底，使溶液位于管底部。只要沉淀没有过分挥干，DNA 在 10min 内就可以用了。注：1）重组
6、 BacmidX 大于 100kb，故在操作过程中应避免机械力剪切，破坏重组粘粒的完整性。2）将提取的 BacmidX 溶液分装，避免冻融次数过多而降低转染效率。IV. 重组 BacmidX 转染 sf9 细胞的操作步骤1. 在六孔板中接种 9105 个细胞/2ml/孔。其中培养基 Graces medium 中含有青霉素 50U/ml，链霉素 50ug/ml，10FBS。2. 27培养 1h，使细胞贴壁。3. 在这期间制备 BacmidX 与 Cellfectin Reagent 复合物a. 用 100ul 不完全 Graces medium（不含双抗、FBS）稀释 1ug BacmidX
7、（约5ul）b. 在使用前将 Cellfectin Reagent 倒置 510 次，使其充分混匀，取 6ul Cellfectin Reagent 用 100ul 不完全 Graces medium（不含双抗、FBS）稀释。c. 将上述两种稀释液合并（总体积约 210ul） ，轻轻混匀，室温孵育1545min。4. 在制备 BacmidX 与 Cellfectin Reagent 复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用 2ml 不完全 Graces medium（不含双抗、FBS）洗涤一次，去掉培养基。5. 在含有 210ul 的复合物的管内加入 800ul 的不完全 Graces medi
8、um（不含双抗、FBS ） ，轻轻混匀，加到每个孔中。6. 将六孔板内的细胞孵育 5h，277. 去掉复合物混合液，然后在每个孔中加 2ml 完全培养基（Graces medium 含双抗、10FBS）8. 在 37湿度培养箱中孵育 72h 或者直到细胞出现病毒感染迹象。注：若细胞生长状态不好会影响转染效率，建议在感染前一天将细胞接种于六孔板。V. P1 病毒原种的(P1)分离与贮存1. 当细胞出现感染迹象时，将上层培养基（约 2ml）转移到无菌带盖的 EP 管中，500g 离心 5min 以去除细胞及大的碎片。可用蛋白结合率低的 0.2um 的滤膜过滤，滴度损失小于 10%。2. 将含病毒的
9、上清液转移到另一个无菌带盖的 EP 管中（一般，P1 的滴度在106 左右） 。将得到的病毒液体避光置于 4冰箱（短期） 。若长期保存，进行 1ml 分装,避光储存于-70 。冻融后,在使用前进行滴度检测 .注：若要低温冻存，建议病毒滴度高一点（108109） ，因冻存时间长了，病毒的滴度将会下降。3. 在进行病毒扩增和蛋白表达之前，需进行病毒滴度计算。VI.病毒滴度测定：设备：超净台40 和 70水浴27 湿度孵箱倒置显微镜材料：30 ml 5105 cells/ml 的对数生长期的活力 sf9 细胞6 孔板 （一次 2 只）(重复利用六孔板,需用 EDTA 溶液浸泡,再用酸泡)1 瓶 4%
10、的 agarose gelGraces medium.(2)(用 Graces medium 培养基配制)1 瓶过滤灭菌细胞培养级的水100ml 的灭菌空瓶（一次一个）0.5ml 澄清，不含细胞经过滤(用 0.2 Graces medium(2),低蛋白结合滤膜)的病毒上清液。100 ml 的不含 FBS 和双抗的 Graces medium(1)20 ml 的灭活小牛血清1. 在无菌操作下，每孔加入 2ml 的悬浮细胞。2. 室温 1h，使细胞贴壁.3. 微波将胶融化,放置 70水浴防凝结，将空瓶和 Graces medium.(2)置 42水浴。(42 为最适温度)4. 室温 1h 后，在
11、显微镜下观察细胞贴壁，并达到 50%的融合。5. 在 0.5ml 的病毒上清中加入 4.5ml 的不含 FBS 和不含双抗的 Graces medium(1)进行稀释，依次，对病毒上清进行 10-1 至 10-8 的稀释。 （可采用 5-ml 的管子）6. 将 6 孔板和稀释的病毒溶液放置超净台，在两个六孔板上做上相同记号， “10-3， 10-4，10-5，10-6，10-7，10-8”7. 将每个孔中的上清移走，用 PBS(1x)轻轻洗涤,在每个孔中加入 1ml 相应浓度的病毒溶液，室温孵育 1h。8. 制备覆盖液(以下为一块六孔板的量,通常一次一块板)准备 50的水浴 (虽然 42为最适
12、水浴,但由于冬天温度较低, 胶很快凝结, 所以采用稍高一些的温度比较好).当 agarose 液化后，将它从水浴中移至超净台，14ml Graces medium(2)+46.6l 的庆大霉素(15mg/ml)+7ml 的 4%的 agarose 胶+4ml 灭菌水 +3mlFBS，轻轻地混匀，然后将瓶再放置 50水浴，直至使用。6 孔板在室温孵育 1h 后，将 6 孔板与稀释的胶放置在超净台。9. 按病毒浓度从低到高移走病毒接种体，放置 2ml 的稀释凝胶，操作需迅速，以防止细胞单层干燥,并防止气泡的产生。10. 10 至 20min，待胶变硬之后。用保鲜膜包好.11. 放入 27湿度孵箱孵
13、育 4 至 10 天。12. 在每个空中加入 1mg/ml 的台盼蓝染色 1ml,如果噬斑明显的话,1 小时就能看出.噬斑需出现线性变化,才能正确估计病毒的滴度.13. 孵育至连续两天菌斑数不再产生变化。14. 计算滴度，孔中理想菌斑数为 3 至 20 个。计算公式：puf/ml( 原代病毒)=1/稀释倍数 噬斑数 1/（病毒量 ml /孔）VII 病毒的扩增:1. 原代病毒滴度(P1)较低,介于 1106-1107,扩增后滴度为 1107-1108.2. 采用 6 孔板,2106 细胞/孔,细胞活力97%3. 在每个孔中加入适量的病毒.扩增病毒时可用下列公式进行计算：MOI：Multipli
14、city of infection 在 0.01 至 0.1 之间接种量 （ml）： desired MOI (phf/ml) (total number of cells)tlter of viral inoculum (puf/ml) 感染细胞 48 h 收集的病毒扩增的将近 100 倍，超过 48h 收集的病毒质量较低。每种病毒的收集时间都有一定的差别,如在 72h 收集,但是随着细胞的裂解,病毒的增殖活力会受损4 收集病毒上清,500g 离心 5min.转移上清至灭菌管,得到 P2 病毒.保存如上所述.5滴度实验检测 P2 的滴度 .6述方法进行病毒 P3 的扩增 .7如病毒在-70储
15、存过 ,在一定时间后,滴度会降低 ,在用于蛋白扩增前,需先进行病毒扩增.VIII.用重组的杆状病毒感染 sf9 昆虫细胞进行蛋白表达分析。感染细胞的条件要进行优化：1. MOI 的优化在同的 MOI 值条件下感染细胞，进行蛋白表达分析。2. 时间优化在一定的 MOI 值条件下感染细胞，在不同时间段后对蛋白表达进行分析。异源蛋白的产生需要考虑的方面1 成功的用重组病毒感染昆虫细胞所收培养基营养成分和外界环境影响不是很大，一般用恒定的 MOI 值感染处于对数生长期的细胞。2 不同的细胞系之间需要优化 MOI 值，应该考察各个细胞系感染的不同感染动力学，然后决定病毒和蛋白产物生成的优化参数。3 当需
16、要收集不闭塞的病毒时，建议细胞密度为 1106 至 2106。MOI 值为0.01 至 0.1，对于重组蛋白的生成，建议 MOI 值为 0.5 至 10。4 BEVS 重组基因生成物可为分泌型，也可能不是分泌型的。分泌型的蛋白最大表达量一般在感染 30 至 72 小时后，而非分泌型的蛋白最大表达量一般在感染 48 至 96 后。对每个感染系统的蛋白动力学参数应该进行考察，因为表达的蛋白可能被细胞中蛋白降解酶降解。IX.Sf9 细胞培养单层培养细胞培养瓶“T-flask ,25- and 75-cm2 ”单层培养细胞能在 2 至 4 天达到汇合，大多以建立的昆虫细胞系不具备锚地依赖性，介于贴壁和
17、悬浮之间活力不改变. 本实验室采用 Graces medium (1) +10%FBS+1%双抗(100x)1. 吸取单细胞层上的培养液和悬浮的细胞，弃掉。2. 在每个 25-cm2 flask 中加 4ml 的室温全培养基。3. 用吸管重悬细胞。酶消化法不被建议采用。在倒置显微镜下观察细胞，确定细胞全部离壁。4. 进行细胞活力计数（用 trypan 染色法）5. 稀释细胞密度至 2105 于每个培养瓶中6. 在 27.528.5条件下培养，盖子稍松以保证氧气的交换。7. 培养后 4 天，吸取上清，按上述步骤重复传代8. 对于有些长的慢的细胞，去上清，在单层细胞的另一边轻轻加入新鲜的培养液。9
18、. 在细胞汇合度达到 80-100%时进行传代。 （大约在 24 天后进行第二次传代）细胞冻存1 悬浮培养细胞至对数生长期，活力超过 90%。2 计数，使得储存浓度为 1107 /ml 至 2107 /ml。3 准备所需量的储存培养液，对于含有小牛血清的培养液，加 DMSO 至 7.5%和FBS 至 10%，预冷培养液保存于 4。4 离心悬浮细胞或单层细胞 100g，5min，用预冷的冻存液悬浮至所需密度。5 混匀，分装至冻存管。6 将冻存管放入填有脱脂棉的泡沫盒,-70放置 1 天。7 移入液氮罐中保存.细胞复苏1 取出冻存管快速放置于 36.5至 37.5融化。2 用 70%的乙醇擦拭冻存
19、管口。3 把冻存管中所有的冻存液转移至摇瓶中，稀释活力细胞浓度至 3105 /ml至 5105/ml。4 在常规培养之前，最初两次传代的细胞浓度维持在 0.3106 /ml 至 1106/ml之间。昆虫细胞的低 MOI 杆病毒感染 昆虫细胞的低 MOI 杆病毒感染 感染悬浮细胞是使杆病毒系统生产蛋白的普遍方法。悬浮培养的细胞很容易从 10ml 扩大到 100L。一般来说，悬浮的细胞在无血清的培养液中培养。这种培养液许多公司有售，比如 Life Technologies、Hyclone、Biowhitaker、JRH Biosciences、Expression Systems 等，用起来都不错
20、，尽管由于细胞株和目的蛋白的不同，效果有所差异。最好是将目的蛋白和细胞株用不同的培养液做一个表达试验，选出表达效果最好的一种培养液。在进行这个表达试验之前要先使你的细胞株分别适应不同的培养液，否则试验结果不具有代表性。注意：为了优化表达，你必须了解你的细胞的生长参数；为了方便新手，我将列出一些生长参数通常的值。我最喜欢的 Sf9 细胞株可以最低以 2105细胞/ml 的浓度分装，并且恢复几乎没有滞后期。在对数期，20 个小时细胞数目就可以翻倍，浓度最高可以达到5106细胞/ml。下面的实验步骤将以上面列出的生长参数为前提。如果你的细胞株生长参数有所不同，你需要对实验步骤做出合适的调整。低 MO
21、I 感染简介低 MOI（Multiplicity Of Infection，等于用于感染的病毒数目与细胞数目的比值）感染是扩增病毒的最好方法。这有两个原因。一方面，低 MOI 感染是最快也是最简单的扩增病毒数量的方法；另外，低 MOI 感染是保存病毒基因的完整性、防止 DIP（Defective Interfering Particles，即只包装入部分基因组的病毒颗粒）生成的最好方法。还可以用低 MOI 感染的方法生产蛋白，但是难以控制，并且不适于提高蛋白产量。然而病毒需要量少的确是该法的一个优点，对于大规模的生产这个优点极为有利，只要它们可以可靠的复制，这因不同的重组病毒而异。对于小规模的
22、蛋白生产，我更喜欢用高 MOI感染。一般而言，低 MOI 感染的方法就是先用病毒感染少量细胞，这些被感染的细胞复制出足够的病毒，去感染培养物中剩余的尚未被感染的细胞，而这第二批被感染的细胞就是病毒或者蛋白的主要生产者。重要的是培养液的量要满足细胞生长的需要，否则将没有足够的营养使细胞生产病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死。最理想的是，先确定在没有病毒感染时，细胞保持正常状态所能达到的最大密度，那么如果病毒的量能够使细胞在达到该密度的 1/32/3 时停止扩增是最理想的。我通常是使用该密度的 1/2。采用这个方法需要使用足够的病毒感染
23、细胞，在 2448 小时内使细胞停止增长、所有的细胞都被感染。因此，以生长停止作为完全感染的标志，培养物在达到完全感染后可以继续生长大约 48 小时。如果以生产蛋白为目的，这个过程可能需要更长。步骤：将细胞以 24105细胞/ml 的密度分装到摇瓶中，达到摇瓶体积的 2040%。在272培养，转速为 100130rpm。第 0 天培养细胞至密度达到 48105细胞/ml，即已经进入对数期生长，但是仍处于低浓度。然后加入少量病毒，病毒量依赖于滴度，但是最好使 MOI 值介于 0.10.5。比如，如果你的细胞浓度为 6105细胞/ml，而病毒滴度为 3107pfu/ml，那么要使 MOI 介于0.
24、10.5，所加的病毒的体积应该是细胞体积的 0.21%。将摇瓶放回 27摇床，培养 24 小时。感染后第 1 天计数细胞，估计细胞大小。如果病毒的实际滴度比估计的高，即 MOI 值高于 0.5，你将看到明显的细胞停止生长和肿胀的迹象；反之，如果 MOI 值接近 0.3 或者更低，你将看到细胞几乎没有受到病毒影响，它们的数目扩增到接近 1.2106细胞/ml，并且看起来健康。这个时候，被感染的细胞应该正在释放病毒至培养液中，去感染其它细胞。感染后第 2 天再次计数细胞并且估计细胞的大小。此时大多数细胞应该已经被感染。细胞的数目应该远远低于 2.4106细胞/ml（这是在没有病毒感染的情况下细胞正
25、常生长应该达到的密度），并且明显膨胀。如果细胞的数目在感染后第 0 天和第 1 天之间没有增长，可能是所有的细胞都被同时感染所致，在感染后第二天就可以收获了。如果不是这种情况，将摇瓶放回 27摇床，培养 24 小时。感染后第 3 天再次计数细胞，估计细胞大小。如果实验进展与预料一致，此时的细胞数目与第 2 天比应该没有增长。如果细胞数目在感染后第 1 天和第 2 天之间就已经停止增长，这说明所有的细胞在感染后第 1 天就已经被全部感染，此时可以收获细胞，因为感染时间已经达到 48 小时，这是一般的情况。如果细胞数目在感染后第 1 天和第 2 天之间仍然有一定增长，并且此时尚未达到平台期，将摇瓶
26、放回 27摇床，培养 24 小时。感染后第 4 天再次计数细胞，估计细胞大小。此时最好所有的细胞都被彻底感染、膨胀、生长停止，否则说明用于感染的病毒的量不够，不能在细胞生长达到平台期前使其停止。此时应该收获培养物，离心分离细胞，将培养液避光保存于 4，或者冻存于 -70。通常最好将细胞沉淀冻存。我喜欢的方法是将细胞重悬于小量（比如 1/4 体积）的 PBS 或者 TBS（含有浓度为通常 5 倍的蛋白酶抑制剂）中，充分重悬后直接用微量移液器加入充满液氮的干净 Dewar 瓶中。滴下的重悬物遇到液氮迅速冻结形成小球，这些小球可以被分装到 50ml 圆锥管中，冻存于 Revco 冰箱中。当需要从细胞
27、中纯化蛋白时，只需将这些小球逐个加入到 35 倍体积室温下不断搅拌的裂解缓冲液中，它们将很快融化，使缓冲液降至接近 0。这些小球还可以用镊子方便的转移到 eppendorf 管中作小量实验。低熔点琼脂糖有以下 4 种：SeaPlaque 琼脂糖 属分子生物学级别,是一种低熔点琼脂糖，所制凝胶具有更高的筛过特性，更透明。是理想的 DNA 和 RNA 电泳产品，也适合组织培养细胞的克隆和病毒空斑分析。为保证在凝胶中进行的 DNA 酶反应不受影响，特推荐使用 SeaPlaque GTG 琼脂糖，这种琼脂糖已被证明其对一些常规性的用于胶内操作（如限制型消化，克隆）的酶显示出最小的抑制作用。分析说明：熔
28、化温度（1.5%）： 65 胶凝温度（1.5%）： 26-30湿度： 10% 硫酸盐 ： 0.10%EEO（-Mr）： 0.10 凝胶强度（1%）： 200g/cm2DNase 和 RNase 活性 未检测到应用： DNA 和 RNA 电泳 、病毒空斑检测、细胞培养订购信息 目 录号 品 名 规 格50101 SeaPlaque Agarose 25 克50100 SeaPlaque Agarose 125 克 SeaPlaque GTG 琼脂糖 属遗传学技术级别，用于分离大于 1000bp 的 DNA 和 PCR 产物片段。这种低熔点琼脂糖最适于直接对重熔琼脂糖中的核酸进行酶学操作，而无需额
29、外的 DNA 纯化步骤；也适合在重熔琼脂糖凝胶中进行 PCR 及测序反应。分析说明：熔化温度（1.5%）： 65 胶凝温度（1.5%）： 18-26湿度： 10% 硫酸盐： 0.10%EEO（-mr)： 0.1 凝胶强度（1%)： 200g/cm2应用：大片段 DNA 的分析和回收、凝胶内 PCR 反应（In-gelPCR）、凝胶内（In-gel）连接和转化实验、DNA 和 RNA 的消化。性能和质量检测重熔凝胶中的酶活性：T4DNA 连接酶活性检测及转化测试。Hind和 EcoR限制性消化检测。分辨率：能有效分辨1000bp 的 DNA 片段。凝胶背景：经溴化乙锭染色后仅显示出低的荧光背景。
30、DNase 和 RNase 活性：未检测到。DNA 结合：未检测到。订购信息 目 录号 品 名 规 格50111 SeaPlaque GTG Agarose 25 克50110 SeaPlaque GTG Agarose 125 克 SeaPrep 琼脂糖 是一种独特的“软琼脂糖”，具有超低的胶凝及熔化温度。用于杂交瘤克隆及制造软的，高纯度凝胶。它以一种严格的具有代表性的模式扩增 cDNA 文库，减少在扩增的过程中由于不同复制率所引起的低丰度克隆丢失的可能性。分析说明： 胶凝温度（0.8%）： 8-17 溶化温度（ 1.0%）： 50湿度： 10% 硫酸盐： 0.10%EEO(-Mr)： 0.05 凝胶强度(2%)： 75g/cm2
