做好毛细管电泳的意义.doc

1、做好毛细管电泳的意义随 着 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 及 生 物 医 学 研 究 的 日 益 深 入 ， 研 究 人 员 对 与 生 命 现 象 有关 的 分 子 的 分 离 分 析 技 术 提 出 了 愈 来 愈 高 的 要 求 。 本 文 就 近 年 来 发 展 的 毛 细 管 电 泳及 其 在 生 命 科 学 中 的 应 用 作 些 介 绍 。1.毛 细 管 电 泳 仪 简 介毛 细 管 电 泳 仪 商 品 虽 然 外 型 各 异 ， 但 不 外 乎 由 下 列 几 个 部 分 构 成 :1.毛 细 管 ;2.高 压 电 源 ;3.电 极 及 电 极 液 ;4.在 线 检

2、测 器 ;5.恒 温 装 置 ;6.样 品 盘 ;7.数 据 收 集 和 处理 系 统 (记 录 仪 、 积 分 仪 、 电 脑 )。毛 细 管 是 由 熔 融 石 英 加 工 制 得 ， 为 克 服 石 英 极 脆 易 断 的 缺 点 ， 在 其 外 壁 涂 抹 了一 层 聚 亚 胺 酷 以 增 加 毛 细 管 的 柔 性 。 检 测 器 位 于 距 样 品 盘 约 毛 细 管 总 长 的 三 分 之 二至 五 分 之 四 处 ， 对 毛 细 管 壁 内 部 分 进 行 光 学 聚 焦 。 在 线 检 测 器 有 紫 外 、 荧 光 和 激 光等 多 种 检 测 方 式 ， 目 前 较 为

3、常 见 的 是 紫 外 检 测 。 此 外 ， 将 毛 细 管 电 泳 仪 和 质 谱 仪 联用 也 已 见 报 道 。毛 细 管 中 充 满 具 有 一 定 离 子 强 度 的 缓 冲 液 后 ， 在 其 两 端 加 上 高 电 压 ， 被 分 析 物除 受 电 场 力 的 作 用 外 ， 还 受 电 渗 流 作 用 。 毛 细 管 内 壁 的 石 英 分 子 在 一 般 水 性 环 境 中(pH2.0 以 上 )因 HZSIO3 分 子 的 解 离 ， 其 表 面 形 成 一 层 负 电 荷 ， 吸 引 缓 冲 液 中 的 正离 子 ， 这 一 层 正 离 子 在 电 场 的 作 用 下

4、趋 向 阴 极 ， 从 而 带 动 毛 细 管 内 整 个 溶 液 向 阴 极移 动 。 此 电 渗 现 象 在 毛 细 管 电 泳 中 起 着 举 足 轻 重 的 作 用 。 虽 然 被 分 离 的 混 合 物 中 各分 子 在 特 定 的 电 泳 缓 冲 液 中 带 有 不 同 的 净 电 荷 ， 但 在 电 渗 作 用 下 均 向 阴 极 方 向 泳 动 。其 最 终 的 迁 移 力 由 电 渗 、 缓 冲 液 条 件 及 分 子 本 身 的 泳 动 力 决 定 。 其 中 泳 动 力 和 分 子的 荷 质 比 有 关 。内 壁 石 英 分 子 除 能 造 成 电 渗 流 外 ， 还 具

5、 有 吸 附 溶 质 中 带 正 电 荷 分 子 的 能 力 ， 从而 会 影 响 分 离 效 果 。 为 避 免 分 析 物 被 管 壁 吸 附 ， 可 选 用 缓 冲 液 的 pH 大 于 样 品 混合 物 中 蛋 白 质 和 多 肤 的 等 电 点 ， 此 时 被 分 析 物 与 管 壁 带 同 种 电 荷 ;或 者 选 用 pH接 近 pHZ.o， 此 时 毛 细 管 内 壁 无 解 离 的 负 电 荷 ， 但 此 酸 性 环 境 易 造 成 蛋 白 质 变 性 失活 ， 一 般 仅 用 于 多 肤 分 析 。 也 可 对 毛 细 管 内 壁 进 行 涂 层 ， 如 中 性 共 价 涂

6、 层 以 消 除 电渗 ， 或 采 用 改 变 内 壁 电 荷 的 极 性 的 可 逆 涂 层 方 法 ， 适 于 等 电 点 偏 高 的 蛋 白 质 的 分 离分 析 。与 平 板 凝 胶 电 泳 手 工 上 样 方 式 不 同 ， 毛 细 管 电 泳 采 用 两 种 自 动 进 样 方 式 :流体 静 力 进 样 (通 过 压 力 推 动 或 真 空 吸 入 )和 电 动 进 样 。 每 次 进 样 量 为 几 纳 升 ， 一 般 仅可 用 于 分 析 鉴 定 。 如 要 收 集 分 离 产 物 并 进 行 进 一 步 研 究 ， 则 需 重 复 多 次 分 析 以 富 集分 离 到 的

7、产 物 。 1992 年 Huang 和 Mathies 等 报 道 毛 细 管 束 电 泳 的 实 验 结 果 ， 数 十乃 至 上 百 根 毛 细 管 平 行 排 列 ， 分 离 得 到 的 产 品 产 量 能 提 高 二 个 数 量 级 。2.毛 细 管 电 泳 的 几 种 分 离 模 式毛 细 管 电 泳 根 据 分 离 机 理 等 不 同 ， 类 似 于 液 相 色 谱 的 归 类 ， 分 成 几 种 分 离 模 式 ，主 要 为 以 下 几 种 :2.1.自 由 溶 液 毛 细 管 电 泳 (FSCE)或 称毛 细 管 区 带 电 泳 (CZE)毛 细 管 中 只 充 有 电 泳

8、缓 冲 液 ， 根 据 被 分 析 物 的 荷 质 比 差异 进 行 分 离 。 应 用 最 广 泛 、 已 见 报 道 的 例 子 有 多 肤 、 蛋 白 质 和 核 酸 等 生 物 大 分 子 的分 离 以 及 无 机 离 子 、 氨 基 酸 、 药 类 等 小 分 子 的 分 析 。2.2.毛 细 管 等 电 聚 燕 (CIEF)根 据 蛋白 质 和 多 肤 的 等 电 点 进 行 分 离 。 需 选 用 内 壁 中 性 共 价 涂 层 的 毛 细 管 ， 阳 极 端 至检 测 器 有 效 分 离 部 分 (离 检 测 窗 口 差 几 厘 米 )充 满 两 性 电 解 质 溶 液 ， 样

9、 品 溶 液 夹 在其 中 以 避 免 直 接 接 触 阳 极 液 (H3P04)。 毛 细 管 其 余 部 分 (检 测 器 至 阴 极 )为 阴 极 液(NaOH 溶 液 )。 毛 细 管 两 端 分 别 插 入 阳 极 和 阴 极 液 中 ， 其 中 毛 细 管 中 的 溶 液 和H3PO溶 液 中 均 含 一 定 浓 度 的 可 溶 性 甲 基 纤 维 素 作 为 支 持 介 质 。 两 性 电 解 质 载 体 和样 品 在 电 场 中 聚 焦 至 电 流 趋 于 零 ， 通 过 压 力 或 在 正 负 极 加 盐 等 方 式 ， 不 同 等 电 点 的样 品 逐 一 经 过 检 测

10、窗 口 。 此 方 法 除 了 能 测 定 蛋 白 质 和 多 肤 的 等 电 点 外 ， 还 可 鉴 定 蛋白 质 的 纯 度 及 分 析 不 同 变 异 体 。 毛 细 管 等 电 聚 焦 具 有 比 凝 胶 等 电 聚 焦 更 高 的 分 辨 力 ，即 使 选 用 广 范 围 的 两 性 电 解 质 (PH310)， 也 可 分 辨 相 差 一 个 净 电 荷 的 天 然 蛋 白 质和 其 突 变 体 。 由 于 是 直 接 在 线 检 测 ， 可 分 析 多 肤 的 等 电 点 ， 而 在 传 统 凝 胶 等 电 聚 焦中 的 固 定 、 染 色 、 脱 色 等 步 骤 中 小 分 子

11、 多 肤 易 丢 失 。 整 个 分 析 过 程 可 自 动 化 ， 通 常仅 需 45 分 钟 左 右 。2.3 毛 细 管 凝 胶 电 泳 (CGE)根 据 被 分析 物 的 荷 质 比 分 离 ， 当 凝 胶 中 含 有 SDS 等 去 垢 剂 时 ， 则 根 据 它 们 的 分 子 大 小进 行 分 离 。 主 要 用 于 蛋 白 质 、 部 分 多 肤 和 DNA 分 离 。 毛 细 管 内 的 分 离 介 质 可 以如 平 板 电 泳 一 样 呈 凝 胶 状 ， 也 可 以 是 甲 基 纤 维 素 溶 液 ， 后 者 便 于 清 洗 ， 可 实 现 毛 细管 一 管 多 用 。 溶

12、 液 中 的 甲 基 纤 维 素 分 子 在 电 子 显 微 镜 中 呈 现 缠 绕 状 ， 其 作 用 机 理 类似 于 凝 胶 的 筛 网 作 用 。2.4.微 团 电 动 毛 细 管 色 谱 (MECC)在 电 泳 缓 冲 液 中 加 人 一 定 浓 度 的 去 垢 剂 ， 如 SDS 及 其 类 似 物 ， 这 些 分 子 一 端为 亲 水 基 团 ， 其 余 部 分 为 疏 水 结 构 ， 在 溶 液 中 聚 集 成 一 个 个 微 团 ， 称 为 假 固 相 ， 被分 析 的 样 品 根 据 其 在 假 固 相 和 溶 液 相 中 的 分 配 进 行 分 离 。 此 方 式 主 要

13、 用 于 小 分 子 (如氨 基 酸 等 )和 多 肤 的 分 离 。3.毛 细 管 电 泳 在 生 命 科 学 中 的 应 用3.1.在 多 肤 研 究 中 的 应 用毛 细 管 电 泳 可 以 分 辨 多 肤 的 细 微 结 构 差 异 ， 如 C 一 端 的 酞 胺 化 与 去 酞 胺 化 ，单 个 氨 基 酸 残 基 的 替 换 ， 氨 基 酸 组 成 相 同 而 序 列 不 同 的 多 肤 也 能 区 别 开 ， 甚 至 表 面电 荷 不 同 而 一 级 结 构 相 同 的 多 肤 也 有 可 能 分 离 开 。 另 外 用 FSCE 有 时 能 帮 助 确 定多 肤 内 是 否 存

14、 在 二 硫 键 。3.2.在 蛋 白 质 研 究 中 的 应 用毛 细 管 电 泳 采 用 温 和 非 变 性 条 件 ， 有 利 于 分 析 蛋 白 质 的 细 微 结 构 差 异 并 鉴 定 蛋白 质 的 纯 度 。 例 如 核 糖 核 酸 酶 A、 Bl 和 BZ 一 级 结 构 相 同 ， 差 别 在 于 第 34 位 天冬 酞 胺 残 基 上 糖 基 化 程 度 不 同 。 选 择 一 定 的 电 泳 条 件 可 将 这 三 种 异 构 体 分 开 。 已 知不 少 遗 传 工 程 重 组 蛋 白 需 含 有 与 其 天 然 蛋 白 一 样 的 特 定 多 糖 ， 毛 细 管 电

15、泳 可 监 控 它们 所 结 合 多 糖 的 均 一 性 。 毛 细 管 电 泳 最 近 被 用 来 研 究 细 胞 色 素 C 的 结 构 与 功 能 。Albin 等 报 道 了 用 毛 细 管 电 泳 研 究 其 表 面 修 饰 的 位 点 。 他 们 监 测 了 修 饰 反 应 过 程 ， 比较 了 修 饰 前 后 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 肤 谱 ， 并 收 集 了 含 有 被 修 饰 残 基 的 肤 段 ， 测 定 其 序 列 ，确 定 了 修 饰 试 剂 钉 复 合 物 所 结 合 的 残 基 。由 于 毛 细 管 电 泳 分 析 快 速 ， 可 用 来 监 测 蛋 白 质 化

16、 学 反 应 的 动 力 学 过 程 。 如 分 析RNase 蛋 白 酶 解 产 物 中 含 糖 肤 段 去 糖 昔 化 的 动 力 学 过 程 。 我 们 实 验 室 建 立 了 用 毛 细管 电 泳 测 定 蛋 白 激 酶 A 活 性 的 方 法 ， 其 灵 敏 度 、 精 确 性 和 线 性 范 围 均 不 亚 于 经 典 的同 位 素 法 。除 了 自 由 溶 液 毛 细 管 电 泳 外 ， 毛 细 管 等 电 聚 焦 和 毛 细 管 凝 胶 电 泳 在 蛋 白 质 研 究方 的 应 用 例 子 也 很 多 。 Chen 等 报 道 了 应 用 毛 细 管 等 电 聚 焦 测 定 R

17、Nase 几 种 变 异体 的 等 电 点 ， 它 们 都 接 近 pH 梯 度 的 极 端 值 ， 如RNaseA， Pl9.5;RNaseBa， pl9.0;RNaseTl， pl3.0， 以 往 用 凝 胶 IEF 较 难 测 准 。 图1 为 我 们 实 验 室 应 用 CIEF 测 定 重 组 人 表 皮 生 长 因 子 (rhEGF)的 等 电 点 ， 经 分 析 其pl 为 5.0。应 用 毛 细 管 SDS 凝 胶 电 泳 可 以 比 较 方 便 地 分 析 糖 蛋 白 的 分 子 量 。 由 于 多 糖 基 团不 结 合 SDS， 糖 蛋 白 的 荷 质 比 相 对 于 同

18、样 大 小 的 蛋 白 质 低 ， 用 经 典 的 SDS 一 聚丙 烯 酞 胺 凝 胶 电 泳 估 计 的 分 子 量 偏 大 ， 通 常 必 须 在 不 同 浓 度 的 凝 胶 上 进 行 分 析 ， 得到 糖 蛋 白 迁 移 率 对 数 值 相 对 于 凝 胶 浓 度 的 线 性 关 系 图 (Ferguson 图 )， 该 直 线 的 斜率 称 为 此 蛋 白 的 排组 系 数 Kr。 Kr 和 蛋 白 质 的 半 径 的 平 方 成 正 比 ， 而 蛋 白 质 半 径 与 其 分 子 量 的 对数 成 线 性 ， 因 此 得 到 标 准 蛋 白 分 子 量 的 fog 值 相 对 于

19、 Kr 平 方 根 的 线 性 关 系 图 ，测 得 糖 蛋 白 的 Kr 值 即 可 推 测 其 分 子 量 。 运 用 传 统 的 平 板 凝 胶 电 泳 需 多 次 灌 胶 多 次电 泳 ， 而 毛 细 管 凝 胶 电 泳 应 用 溶 液 状 的 分 离 介 质 只 需 对 浓 的 含 甲 基 纤 维 素 的 分 离 溶液 进 行 一 系 列 的 稀 释 ， 按 照 设 定 的 程 序 自 动 分 析 即 可 得 到 Ferguson 图 。3.3 在 核 酸 研 究 中 的 应 用核 酸 分 离 主 要 是 将 不 同 大 小 片 段 分 开 ， 由 于 含 有 不 同 个 数 碱 基

20、 对 的 DNA 分子 (即 长 度 不 同 )其 荷 质 比 相 同 ， 因 而 用 自 由 溶 液 毛 细 管 电 泳 不 能 将 它 们 分 离 。 应 用毛 细 管 凝 胶 电 泳 模 式 可 解 决 这 一 问 题 。 目 前 作 为 核 酸 分 离 介 质 的 分 子 筛 填 充 料 有 两种 :一 种 如 同 平 板 凝 胶 ， 呈 共 价 交 联 固 定 状 ;另 一 种 为 可 流 动 的 、 无 交 联 的 多 聚 物(如 聚 丙 烯 酞 胺 或 甲 基 纤 维 素 的 衍 生 物 )。应 用 第 一 种 填 料 ， 可 进 行 快 速 、 高 分 辨 力 、 有 效 、

21、灵 敏 的 DNA 序 列 测 定 。Smith 等 在 1990 年 报 道 了 用 毛 细 管 电 泳 进 行 快 速 DNA 测 序 的 方 法 。 它 们 在 目 前商 品 化 的 DNA 序 列 仪 的 基 础 上 进 行 改 建 ， 用 灌 注 凝 胶 的 毛 细 管 代 替 平 板 凝 胶 ， 改进 了 光 学 部 分 ， 可 同 时 检 测 四 种 波 长 的 荧 光 ， 光 束 聚 焦 在 毛 细 管 5 即 m 内 径 上 。四 种 反 应 产 物 混 合 在 一 起 上 样 至 聚 丙 烯 酸 胺 变 性 凝 胶 ;通 过 测 定 不 同 荧 光 基 团 标 记的 DNA

22、 片 段 ， 通 过 检 测 窗 口 的 次 序 决 定 DNA 序 列 。 平 板 凝 胶 电 泳 每 天 可 分 析lokb， 毛 细 管 凝 胶 电 泳 可 达 600kb， 分 析 速 度 快 了 数 十 倍 。用 甲 基 纤 维 素 衍 生 物 作 为 分 离 介 质 适 用 于 分 离 单 碱 基 差 异 的 DNA 片 段 ， 因而 可 分 析 引 物 的 纯 度 (用 于 DNA 测 序 、 扩 增 或 点 突 变 )， 以 及 鉴 定 分 离 基 因 的 探 针和 用 于 克 隆 的 连 接 片 段 。 应 用 嗅 乙 锭 染 料 结 合 紫 外 检 测 或 荧 光 染 料

23、花 青 素 结 合 激 光诱 导 的 荧 光 检 测 ， 灵 敏 度 可 提 高 上 千 倍 (nx10mol.， 一 5fg)， 因 而 可 以 诊 断 遗 传 疾病 ， 分 析 特 殊 染 色 体 的 基 因 谱 图 乃 至 法 医 学 鉴 定 。 但 这 一 方 法 用 来 分 离 含 几 千 以 上碱 基 的 DNA 片 段 尚 有 困 难 。3.4.用 于 其 它 分 子 分 析应 用 毛 细 管 凝 胶 电 泳 结 合 激 光 诱 导 荧 光 检 测 分 离 经 荧 光 标 记 的 多 聚 糖 混 合 物 ，具 有 较 高 的 分 辨 力 ， 可 分 离 多 聚 半 乳 糖 醛 酸

24、 部 分 水 解 产 生 的 含 不 同 个 数 单 糖 的 一 系列 聚 合 物 。应 用 MECC 可 进 行 兴 奋 剂 分 析 ， 在 一 次 电 泳 中 能 将 以 下 几 种 兴 奋 剂 分 离 :苯丙 醇 胺 、 麻 黄 碱 、 安 非 他 命 、 Mephentermine、 可 卡 因 、 脱 氧 麻 黄 碱 。 1994 年 美国 世 界 杯 足 球 赛 中 著 名 球 星 马 拉 多 纳 被 查 出 服 用 的 兴 奋 剂 即 为 麻 黄 碱 及 其 类 似 物 。感 冒 药 康 泰 克 中 则 含 有 苯 丙 醇 胺 。4.前 景毛 细 管 电 泳 今 后 发 展 的 方 向 仍 是 提 高 分 辨 力 和 速 度 ， 以 满 足 生 命 科 学 研 究 日 新月 异 发 展 的 要 求 ， 另 外 将 它 与 质 谱 仪 更 好 地 结 合 ， 可 对 生 物 分 子 特 性 作 出 更 快 、 更准 的 分 析 ， 并 能 拓 宽 毛 细 管 电 泳 的 应 用 领 域 。