1、几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于 46 进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。1.3 调 pH 值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸
2、（0.1mol/L 盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调 pH 值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(45mL) ，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。1.7 灭菌根据要求
3、将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为 121，1520min。1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常 30培养 13 天。无菌检查合格后将其保存于 4下备用。2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等） 。2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”
4、字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。2.1.5 挖块接种法挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。2.2 穿刺接种用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底） ，然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。2.3 液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。3 培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为 3037，真菌培养温度一般为 2528。4 保藏培养好的菌种于 46 保存，根据要求每 36
5、个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须 13 个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为 50%70% 。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。液体石蜡保藏法亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（46）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤如下：1 液体石蜡的准备选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：121湿热灭菌 30min，置 40恒温箱中蒸发水分，经无菌检
6、查后备用。160干热灭菌 2 个小时，冷却后，经无菌检查后备用。2 斜面培养物的制备参照定期移植法。3 灌注石蜡 将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部 1cm 左右，使菌体与空气隔绝。4 保藏4.1 注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4 6）干燥处保藏，保藏时间 210 年。4.2 保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。5 恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。沙土管保藏法是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟
7、孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于 46 或室温进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤如下：1 沙土管制备将河沙用 60 目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用 80 目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用 10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用 20%盐酸浸泡。 24 小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。另取地面下 4060cm 非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100 目过筛,水洗至中性，烘干。将处理后的沙、土按质量比 21 混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为 1cm 左右，塞好棉塞，121
8、湿热灭菌 30min。随机抽取灭菌后的砂土管若干支，无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中，30培养 24 小时，检查无微生物生长后方可使用。2 斜面培养物的制备参照定期移植法。3 制备菌悬液向培养好的斜面培养物中注入 35mL 无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管 0.20.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。4 干燥真空抽去沙土管中水分。5 保藏将沙土管用火焰熔封后存放于低温(46)干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。 保藏时间 2 10 年。6 恢复培养无菌条件下打开沙土管
9、，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。冷冻干燥将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。操作步骤如下：好氧菌冷冻干燥管的制备1 安瓿管准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用 2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121 下高压灭菌 15-20 分钟，备用。2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及 pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶
10、要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在 100间歇煮沸 2-3 次，每次 10-30 分钟，备用。3 冻干样品的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件微生物菌种纯度检测技术规程 （试行） ） ，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于 108-1010 个/ml 为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升 1010 个活细胞菌液 2 毫升 -2.5 毫升，只需 10 毫升琼脂斜面两支） 。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约 0.1-0.2 毫升，若是球形安瓿管，装量为
11、半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在 1-2 小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 预冻一般预冻 2 小时以上，温度达到-20 到-35左右。5 冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为 8-20 小时。6 真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。7 保藏安瓿管应低温避光保藏。8 质量检查冷冻干燥后抽取若干支安瓿管
12、进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。厌氧菌冷冻干燥管的制备主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在 100的沸水中煮沸 15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。复苏方法 先用 70%酒精棉花擦拭安瓿上部， 将安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端， 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。-80低温冷冻保藏将菌种保藏在-80冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。操作步骤如下：1 安瓿管的准备安瓿管材料以中性玻璃
13、为宜。清洗安瓿管时，先用 2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至 pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121 下高压灭菌 15-20 分钟，备用。2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及 pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在 100间歇煮沸 2-3 次，每次 10-30 分钟，备用。3 微生物保藏物的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件微生物菌种纯度检测技术规程 （试行） ） ，与保护剂
14、混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于 108-1010 个/ml 为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升 1010 个活细胞菌液 2 毫升 -2.5 毫升，只需 10 毫升琼脂斜面两支） 。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约 0.1-0.2 毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在 1-2 小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 冻结保藏将安瓿管或塑料冻存管置于-80冰箱中保藏。5 复苏方法从冰箱中取出安瓿管或塑料冻
15、存管，应立即放置 38-40水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需 50 秒 -100 秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。液氮超低温保藏液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。操作步骤如下：1 安瓿管或冻存管的准备用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121下高压灭菌 15-20 分钟，备用。2 保护剂的准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，
16、一般采用 10-20%甘油。3 微生物保藏物的准备微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。分装时注意应在无菌条件下操作。菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约 5-10毫米） ，真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装 1.2-2 毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养 2-10 天后，加入保护剂，待保藏。4 预冻预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降 1为
17、好、使样品冻结到-35。目前常用的有三种控温方法： 程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。 分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20至-40 冰箱中 1-2 小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降 1-1.5。 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。5 保藏将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150，液相中温度为-196。6 复苏方法从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在 38-40水浴中快速
18、复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需 50 秒-100 秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 试剂：都是常用的试剂，一般正规生化试剂代理公司都有，质量上没有大的问题。标准菌验收、制备、保藏、 传代、使用、销毁的管理介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、 传代、使用、销毁的管理规程 规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。 依据: 中国药典 2
19、010 年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0 代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3 代） 。黑曲霉的 0 代菌种为保存于含 15%甘油的 0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 CMCC（B）代表细菌（bacteria ）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查
20、是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的 0 代原始菌种储存于20，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3 代）应检查菌种管是否完好。储存于 2 8 ，有效期为3 个月。3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75% 酒精及 75%酒精棉球3.2 培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙
21、醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3 操作步骤：a.打开洁净工作台。b.在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂） 。d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.50.8 ml 到安瓿中。e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基
22、。g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度 3035，培养 1824 小时；真菌培养温度 2328，培养 35 天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天，若仍未浑浊，灭菌处理。h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体 12 滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置 2328培养 57 天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml ）的吐温-80 的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。i.取
23、经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培养基中按 g 项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入 100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的 h 项下洗脱液按 h 项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入 20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种
24、名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j储备菌种管制备成功，储存于20 ，有效期为三年。3.4 菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在 30 35下培养 23 天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在 2328下培养 7 天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。3.5 污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管3.6 菌种
25、的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第 0 代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第 1 代，直到第 3 代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过 5 代。菌种的传代保藏过程 3.3 项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传第三代时取 1 支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第 3 代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3） 。定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（1 ）从冰箱
26、冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约 30 分钟。（2 ）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。（3 ）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约 30 秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。（4 ）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。 （5 ）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马
27、丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。（6 ）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。（7 ）将已接种好的细菌管置 3035细菌培养箱培养 22 24h，真菌管置 2328 真菌培养箱最多培养 7 天。当工作用菌种传代代数小于 5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4 ） 。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。菌种斜面的培养、保藏条件及时间 菌
28、种 培养条件及时间 培养基 保存条件及时间大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3个月生孢梭菌(CMCC(B)64941) 3035
29、22 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月白色念珠菌(CMCC(F)98001) 2328 最多 7 天 改良马丁琼脂培养基 2 8 保存 3 个月黑曲霉(CMCC(F)98003) 2328 最多 7 天 改良马丁琼脂培养基 2 8 保存 3 个月短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 303522 24h 营养琼脂培养基 2 8 保存 3 个月注：菌种斜面 1 次/周观察状态是否正常。3.7 菌种的使用及销毁每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121 高压蒸汽灭菌 20 分钟。并对操作过程进行记录。
