DGGE操作步骤.doc

1、变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 （ DGGE） 的 溶 液 配 制 、 操 作 步 骤 及 注 意 事 项一 、 实 验 试 剂 及 配 置1、 40%丙 烯 酰 胺 /双 丙 烯 酰 胺 （ 37.5： 1）试 剂 用 量丙 烯 酰 胺 38.93g双 丙 烯 酰 胺 1.07gMilliQ（ 超 纯 水 ） 水 加 到 100mL溶 液 采 用 0.45m 滤 膜 过 滤 ， 储 存 在 42、 0 的 变 性 储 存 液凝 胶 梯 度 6 8 10 1240%丙 烯 酰 胺 /双 丙 烯 酰 胺 15mL 20mL 25mL 30mL50TAE 缓 冲 液 2mL 2mL 2mL 2mL

2、MilliQ 水 83mL 78mL 73mL 68mL总 容 积 100mL 100mL 100mL 100mL3、 100 的 变 性 储 存 液凝 胶 梯 度 6 8 10 1240%丙 烯 酰 胺 /双 丙 烯 酰 胺 15mL 20mL 25mL 30mL50TAE 缓 冲 液 2mL 2mL 2mL 2mL去 离 子 甲 酰 胺 40mL 40mL 40mL 40mL尿 素 42g 42g 42g 42gMilliQ 水 加 到 100mL 加 到 100mL 加 到 100mL 加 到 100mL4、 50TAE 缓 冲 液试 剂 用 量 终 浓 度Tris 碱 242.0g 2

3、M冰 乙 酸 57.1 ml 1M0 5M EDTA， pH8.0 100.0mL50mMMilliQ 水 加 到 1000.0mL将 溶 液 混 合 溶 解 ， 121下 蒸 汽 灭 菌 20-30min,储 存 在 室 温5、 银 染 液 的 配 制 :原 液 ： 8固 定 液 （ 250 ml） ：乙 醇 200 ml冰 乙 酸 10mlMilliQ 水 40ml （ A） ： 1固 定 液 （ 400 ml） ：8固 定 液 50mlMilliQ 水 350ml（ B） 银 染 溶 液 (400ml)：AgNO3 0.6gMilliQ 水 300ml（ C） ： 显 影 剂 （ 500

4、ml） ：NaOH 4.5gMilliQ 水 300 ml 甲 醛 0.9ml6、 10 过 硫 酸 铵 （ APS） ：过 硫 酸 胺 0.3g超 纯 水 3.0ml溶 解 后 使 用 0.45m微 孔 滤 膜 过 滤 ， 4保 存 ， 保 存 时 间 为 1周 。7、 10ml DGGE 加 样 缓 冲 液 ：2 溴 酚 蓝 0.25ml2 二 甲 苯 青 0.25ml100 甘 油 7 mlMilliQ水 2.5ml二 、 不 同 引 物 的 变 性 梯 度1,乳 杆 菌 （ 380bp）变 性 梯 度 0%变 性 储 存 液 100%变 性 储 存 液 TEMED 10%过 硫 酸 铵

5、35 （ 12ml） 7.8ml 4.2ml 13ul 56ul65 （ 12ml） 4.8ml 7.2ml 13ul 56ul2,双 歧 杆 菌 （ 596bp）变 性 梯 度 0%变 性 储 存 液 100%变 性 储 存 液 TEMED 10%过 硫 酸 铵40 （ 12ml） 7.2ml 4.8ml 13ul 56ul70 （ 12ml） 3.6ml 8.4ml 13ul 56ul3,肠 球 菌 （ 300bp）变 性 梯 度 0%变 性 储 存 液 100%变 性 储 存 液 TEMED 10%过 硫 酸 铵40 （ 12ml） 7.2ml 4.8ml 13ul 56ul55 （ 1

6、2ml） 5.4ml 6.6ml 13ul 56ul4,V3 region（ 217bp）变 性 梯 度 0%变 性 储 存 液 100%变 性 储 存 液 TEMED 10%过 硫 酸 铵35 （ 12ml） 7.8ml 4.2ml 13ul 56ul65 （ 12ml） 4.2ml 7.8ml 13ul 56ul60 (12ml) 4.8ml 7.2ml 13ul 56ul5,V6-V8 region (489bp）变 性 梯 度 0%变 性 储 存 液 100%变 性 储 存 液 TEMED 10%过 硫 酸 铵42 （ 12ml） 7ml 5ml 13ul 56ul58 （ 12ml）

7、 5ml 7ml 13ul 56ul浓 缩 胶 ：0%变 性 储 存 液 7ml， TEMED 8ul， 10%过 硫 酸 铵 36ul三 、 实 验 操 作1 封 槽（ 1） 用 95 %乙 醇 擦 净 清 洗 一 大 ， 一 小 两 块 玻 璃 板 ， 干 燥 。（ 2） 用 95 %乙 醇 清 洗 两 个 间 隔 条 ， 并 将 其 置 于 大 块 玻 璃 板 两 侧 边 缘 ， 外边 缘 与 玻 璃 板 边 缘 相 齐 。（ 3） 将 小 块 玻 璃 板 置 于 间 隔 条 上 ， 对 齐 ， 并 用 夹 子 固 定 这 个“sandwich”。2 胶 的 制 备用 不 同 体 积 的

8、 两 种 变 性 剂 和 丙 烯 酰 胺 贮 存 液 配 置 变 性 剂 要 求 浓 度 的 胶 。经 验 上 讲 ， 胶 的 体 积 以 刚 好 覆 盖 胶 板 为 宜 。 本 实 验V3 区 扩 增 产 物 DGGE 采 用 65%和35%的 变 性 剂 浓 度 溶 液 ； 乳 杆 菌 特 异 序 列 扩 增 产 物 DGGE 采 用 60%和 35%的 变 性剂 浓 度 溶 液 。 配 置 方 法 如 下 ：不 同 引 物 的 变 性 梯 度 0 100 总 体 积0% 7mL 0mL 7mL35% 7.8mL 4.2mL 12mL40% 7.2mL 4.8mL 12mL50% 6.0

9、mL 6.0 mL 12 mL60% 4.8 mL 7.2 mL 12 mL65% 4.2 mL 7.8 mL 12 mL(1)清 洗 梯 度 合 成 器 并 使 之 干 燥 ， 并 关 掉 两 个 槽 之 间 的 活 栓 。(2)干 燥 梯 度 合 成 器 的 槽 。(3)分 别 向 两 个 浓 度 的 变 性 剂 溶 液 中 加 4.5 L /mL 10% APS(过 硫 酸 铵 )和 1L/ mL 的 TEMED（ 四甲基乙二胺） ， 搅 拌 均 匀 。(4)把 高 浓 度 变 性 剂 溶 液 加 到 梯 度 合 成 器 右 边 的 槽 中 ， 低 浓 度 变 性 剂溶 液 加 到 梯

10、度 合 成 器 左 边 槽 中 。(5)将 连 接 梯 度 合 成 器 的 出 口 针 头 置 于 胶 板 之 间 并 固 定 。(6)推 动 梯 度 形 成 器 形 成 的 梯 度 分 离 胶 即 注 入 两 层 玻 璃 板 之 间 。 在 混 合 和灌 胶 时 应 避 免 产 生 气 泡 。(7)分 离 胶 灌 完 后 ， 取 出 针 头 ， 将 其 置 于 一 个 锥 形 瓶 中 ， 并 停 止 搅 拌 。(8)冲 洗 梯 度 合 成 器 的 两 个 槽 ， 打 开 泵 ， 排 出 其 中 水 分 。(9)在 浓 缩 胶 中 加 入 10% APS 和 TEMED 并 将 浓 缩 胶 灌

11、 入 两 层 的 玻 璃 板 之 间 。(10)待 浓 缩 胶 充 满 后 ， 在 其 顶 部 插 入 梳 子 （ 避 免 产 生 气 泡 ）， 放 置 1 h。3 电 泳(1)在 电 泳 槽 中 添 加 新 配 置 的 电 泳 缓 冲 液 ， 打 开 电 泳 仪 预 热 到60 。(2)取 掉 梳 子 ， 用 蒸 馏 水 清 洗 没 有 凝 聚 的 胶,并 将 sandwich 固 定 在 电 泳 槽 内 。(3)调 节 缓 冲 液 的 高 度 ， 使 其 刚 刚 超 过 胶 上 的 加 样 孔 。(4)用 缓 冲 液 清 洗 加 样 孔 （ 注 射 器 及 针 头 ）。(5)向 胶 顶 部

12、 的 加 样 孔 中 加 入 PCR 的 产 物 。(6)盖 上 电 泳 仪 的 盖 子 ， 打 开 开 关 ， 电 泳 220 v， 10 min， 随 后 85 v ,16 h。4 染 色(1)电 泳 完 成 后 将 胶 取 出 置 于 一 个 干 净 的 不 锈 钢 或 塑 料 容 器 中， 水 洗 3 次 。(2)加 入 400 mL 1固 定 液 ， 摇 3 min。(3)将 固 定 液 倒 入 在 容 器 中 （ 后 面 操 作 使 用 ）。(4)添 加 200 mL 银 染 溶 液 在 摇 床 上 摇 20 min。(5)弃 去 银 染 溶 液 ， 用 蒸 馏 水 轻 洗 胶 3

13、 次 及 容 器 。(6)添 加 新 鲜 蒸 馏 水 摇 1-2 min。(7)弃 去 蒸 馏 水 ， 添 加 少 量 显 影 溶 液 ， 摇 一 会 儿 ， 直 至 出 现 清 晰 条 带 为 止 。(8)弃 去 显 影 溶 液 ， 加 入 使 用 过 的 1固 定 液 ， 摇 5 min。(9)弃 去 固 定 液 。(10)加 入 蒸 馏 水 摇 2 min,后 弃 去 蒸 馏 水 。(11)取 出 胶 并 置 于 一 个 洁 净 的 玻 璃 板 上 ， 干 燥 ， 照 相 。5 注 意 事 项 ：(1)DGGE 电 泳 中 使 用 有 高 毒 性 和 致 癌 的 一 些 试 剂 ， 故 在 实 验 过 程 中 应 注意 加 强 自 身 的 保 护 ， 如 带 手 套 等 。(2)灌 胶 的 时 候 避 免 产 生 气 泡 。(3)银 染 溶 液 不 能 随 便 放 弃 ， 以 避 免 造 成 环 境 污 染 ， 应 回 收 进 行 统 一 处 理 。(4)染 液 和 显 色 液 不 能 直 接 倒 在 胶 上 ， 防 止 染 色 显 色 不 均 匀 。过硫酸铵（APS）的作用主要是提供自由基，然后在促凝剂 TEMED的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合。TEMED 四 甲 基 乙 二 胺 : 用于配制 PAGE 胶等可以催化过硫酸铵产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合