1、IP 实验原理 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G“特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的 FC 片段的现象开发出来的方法。目前多用 protein A/G 预先结合在 argarose beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A/G 就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫
2、沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads 孵育；抗体 -agarose beads 复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。IP 实验步骤 基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞 IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者 4裂解 30min， 12,000g 离心 30 min 后取上清；(2) 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液将 1g 相应的抗体和 10-50 l protein A/G-beads 加入到细胞裂解液， 4C 缓慢摇晃孵育
3、过夜；(3）免疫沉淀反应后，在 4C 以 3,000 g 速度离心 5 min，将 protein A/G-beads 离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads 用 1ml 裂解缓冲液洗 34 次；最后加入 15l 的 2SDS 加样缓冲液，沸水煮 10 分钟；(4） SDS-PAGE, Western blotting 或进行质谱分析。一、 样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的
4、抗体-agarose beads 孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者 4完成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的 RIPA 裂解液为例（主要含有 pH7.4 左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的 NaCl，一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a 缓冲液：离子缓冲液常采用 pH7.4 的 Hepes 或者 Tris-Cl。b NaCl 浓度一般习惯用 150 mM，这主要是因
5、为 150 mM 接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的 NaCl 浓度并不是均一的，局部 NaCl 的浓度可以低到 50 mM，150 mM 的NaCl 有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的 NaCl 浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加 10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来
6、自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA 抑制金属蛋白酶，通过 Protease Cocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。e 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：- 细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对
7、这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。- 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。二、 抗体-agarose beads 孵育裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80保存 3 个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads 孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入 Protein A 或者 G bead
8、s 孵育过夜，也可以同时加入抗体和 Protein A 或者 G beads 孵育过夜。一般选择 1mg 总蛋白（ 1mg/ml）对应添加 1 ug 抗体，最高可以添加至 5 ug 抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的 IgG，但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白 A 的免疫沉淀，选择膜蛋白 B 来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白 C 的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D 来做阴性对照。同时，为避免 Protein A 或者 G beads 有（非）特异性吸附从而造成免疫沉
9、淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将 Protein A 或者 G beads 与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads 孵育。同时，Protein A 或者 G beads 对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和 Ig 亚型，选择合适的 Protein A 或者 G beads 也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用 Protein A和 Protein G beads 的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。三、 抗体-agarose beads 复合物洗涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合
10、适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads 复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改 NaCl 的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的 SDS 洗涤抗体-agarose beads 复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛（见 IP： Q此步骤对于细胞
11、培养皿中的单层贴壁细胞，可在 10cm 的培养皿中加入 1ml 预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解）。 5. 把锥形管或培养皿放在冰上孵育 30 分钟，并间断性地混匀。 6. 4，10000g 离心细胞裂解物 15 分钟。 7. 小心地收集上清液转置干净的管中备用；此样品可冻存于-80作长期保存。 样品的预清洗(可选做)： 8. 在 eppendorf 管中加入 50ul Protein G bead slurry，并加入 450ul 预冷的细胞裂解液。10000g 离心 30 秒后弃去细胞裂解液; 用 500ul 预冷的细胞裂解液重复洗涤一次，最后用 50ul 预冷的细胞裂解液重悬微球。 9.
12、把洗涤好的 50ul Protein G bead 加入到盛有 500ul 细胞裂解样品的 eppendorf 管中，于冰上孵育 30-60 分钟。 10. 4，10000g 离心 10 分钟后把上清液转移到新的 eppendorf 管。若转移过来的上清液中仍含有 Protein G bead，可以再次离心处理后小心地转移上清到另一新的 eppendorf 管。 免疫沉淀： 11. 在盛有预清洗的细胞裂解样品的 eppendorf 管中加入 5-10ug 相应抗体。（注：抗体的浓度是影响免疫沉淀反应的重要因素；建议实验者进行预实验摸索出合适的使用浓度） 12. 4孵育 1 小时。 13. 加入
13、 50ul 预洗的 Protein G bead slurry（微珠处理参考上面样品的预清洗中第一步方法）。 14. 于 4旋转混匀孵育 1 小时。 15. 4，10000g 离心 eppendorf 管 30 秒。 16. 小心并尽量完全地移除上清液后用 500ul 的细胞裂解液洗涤微珠 3-5 次；为减少非特异背景影响，每次洗涤都要尽量小心并完全地移除上清液。 17. 最后一次洗涤并弃去上清液后加入 50ul 的 Laemmli sample buffer 工作液。旋涡混匀后加热至 90-100十分钟。 18. 10000g 离心 5 分钟，收集上清液。取部分或全部样品用于 SDS-PAG
14、E 电泳，暂时不用的样品可以-20 保存。 缓冲液的制备参考 NP-40 Cell Lysis Buffer：50mM Tris-Hcl pH8.0， 150mM Nacl， 1% NP-40 Protease inhibitor Cocktail：PMSF, 5mg (50ug/ml)Aprotinin, 100ug (1ug/ml)Leupeptin, 100ug (1ug/ml)Pepstatin, 100ug (1ug/ml)100% Ethanol bring up to 1ml,aliquot 七、免疫沉淀（IP）常见问题及解答1用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验？答：抗
15、体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同，和抗原以及 Protein G 或 Protein A 的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于 IP 反应。一般来说，多抗是沉淀反应最好的选择。另外，纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。 2为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂？答：从活性细胞裂解出来的样品中，往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，并且在低温下进行实验。 3溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么？答：多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强表面活性剂的缓
16、冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱表面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合。 4免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例？答：每次沉淀实验之前，考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在 beads 上，残存在上清；缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。 5免疫沉淀应该如何配制细胞裂解液？ 答：适当的细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40 是非离子界面活性剂，作用温和;DOC(sodium de-o
17、xycholate)，SDS 是离子性的强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及盐浓度等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加 TritonX-100，只加 DOC 或 SDS，可能使抗体完全失去活性。免疫沉淀免疫沉淀是利用特异性抗体识别并分离抗原的方法。 材料： 上样 buffer 的配方(用前现配): 2ul 1.25M Tris-HCL , pH 6.8 35ul distilled water 2.5ul 2-mercaptoethanol 12.5ul 10%SDS 10ul 80% glycerol 2ul bromphenol blue TNE buffer: 10m
18、M Tris-HCl pH 8.0 10mM NaCl 0.5mM EDTA 方法： 1用含有 1% NP40 的缓冲液重悬细胞，充分振荡。 2在冰上孵育 30 分钟或 37孵育 1015 分钟 3转入 eppendorf 管中离心 3 分钟 4将上清轻轻倒入一干净试管，加入 4050 ul 抗血清 5冰上孵育 2 小时或 4过夜 6在 TNE 中加入 100ul SPA 和 100ul 5% BSA 7冰上孵育 2 小时 8离心使免疫复合物成球，用 1ml 含 1%NP40,0.5% Na deoxychloate, 0.1% SDS 的 TNE,在用超声波重悬 9加入 70ul 的上样缓冲
19、液，振荡。 10热水中水浴 90 秒，离心 1 分钟，保留上清。 11若不立即实验请低温保存。 （以上资料仅供参考） 免疫细胞化学： 1在无菌消毒的 6 孔板中加入 100，000 个/孔细胞，过夜 2倒掉上清，用 PBS 洗涤一次后立即加入 -20C 的甲醇（注意不要让细胞干掉） ，再将板置于-20C 冰箱 5 分钟，然后倒掉甲醇加入 PHEM 缓冲液，置于 4C。 3加入含合适血清（2.55%）的 PHEM 缓冲液轻微振摇一小时 4加入一抗至封板缓冲液，轻微振摇孵育一小时 5倒掉封板液，加入 PHEM 缓冲液洗涤 4 次，每次 10 分钟 6加入二抗至封板缓冲液，轻微振摇孵育半小时 7倒掉
20、封板液，加入 PHEM 缓冲液洗涤 4 次，每次 10 分钟 8用镊子夹起 coverslip，轻轻去除过多的缓冲液，加入约 20ul“antifade”, 轻轻盖上 coverslip,去掉过多的”antifade” 后置于-20C 避光保存。 试剂配方： PHEM 缓冲液：: 25 mM HEPES 10 mM EGTA 60 mM PIPES 2 mM MgCl2 pH = 6.9 （请以此顺序加入） Antifade: 1 ml 1 mg p-phenylene diamine hydrochloride 溶解在 0.1 ml 10x PBS (20 min 室温) 加入 0.9 ml 100% 甘油，封闭保存不要振摇。 若颜色变成棕色，请不要用了。分装保存在-70 C
