冰冻切片实验步骤.doc

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资源描述

1、全部实验步骤1 取新鲜组织于 4%多聚甲醛固定 24 小时2 30%蔗糖脱水 48 小时以上3 -250C 包埋(冰冻切片机内)4 冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤:冰冻切片 48m,室温放置 30 分钟后,入 4丙酮固定 10 分钟,PBS 洗,5 分钟3 次。用 3%过氧化氢孵育 510 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗, 5 分钟2 次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗?冰冻切片不能用热修复啊!以下是我的步骤:1 冰冻切片室温放置 30 分钟后,入 4丙酮固定 10 分钟,PBS 洗,5 分钟3。用 3过氧化氢孵育5

2、10 分钟, PBS 洗,5 分钟2。2 510正常山羊血清(PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37 孵育 12 小时或 4过夜。3 PBS 冲洗, 5 分钟3 次。4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液,37或室温孵育 30 分钟。PBS 冲洗,5 分钟3 次。5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37或室温孵育 1030 分钟。6 PBS 冲洗, 5 分钟3 次。7 显色剂显色( DAB) 。8 自来水充分冲洗,复染,封片。冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶,最好是用 3%H2O2/甲醇溶液,室温 20 分钟。此配方不易产

3、生脱片。配制方法是在 9ml 甲醇中加 30%H2O2 1ml,混匀后使用,每次新鲜配制。冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 48mm,室温放置 30 分钟后,入 4丙酮固定 10 分钟,PBS 洗,5 分钟3。用 3过氧化氢孵育 510 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗,5 分钟 2。 下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化染色步骤:(SP 试剂盒为例)1 冰冻切片 48um,室温放置 30 分钟后,入 4丙酮固定 10 分钟,PBS 洗,5 分钟3。用 3过氧化氢孵育 510 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗,5 分钟 2。2 510正常山羊血清(PBS 稀释)封闭,室

4、温孵育 10 分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37 孵育 12 小时或 4过夜。3 PBS 冲洗, 5 分钟3 次。4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS 稀释) ,37孵育 1030 分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37 或室温孵育 1030 分钟。PBS 冲洗,5 分钟3 次。5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释) ,37孵育 1030 分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37 或室温孵育 1030 分钟。6 PBS 冲洗, 5 分钟3 次。7 显色剂显色( DAB 或 AEC) 。8 自来水充分冲洗,复染,封片

5、。1. 冰冻切片 4um 左右,室温 25C 复温 30min,浸入 4C 预冷的丙酮固定 10min,2. PBS(PH 为 7.2-7.4)在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次,每次 5min(第一次冲洗时间短些,约1min 后更换)3. 用 3%过氧化氢一份,纯甲醇 50 份(需要现配,避光条件封闭,可以用纸盒盖住皿)30min。4. PBS(PH 为 7.2-7.4,酸性)在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次,每次 5min(第一次冲洗时间短些,约 1min 后更换) ,甩去 PBS,擦干切片周围的水分,用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈,距离组织不宜太近,与切片组织保持 5mm 左

6、右距离,太近会导致边缘效应。5. 5%BSA,室温孵育 20min,期间注意观察,以免 BSA 干燥而导致背景太高,请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。6. 甩去血清,PBS 洗 1min,擦干周边水分,圈内可不擦,但尽量要甩干,以免导致抗体浓度不均。7. 配置一抗工作液用 5%BSA(抗体浓度为 1:100) ,悬空加入一抗工作液 50-100ul,枪头不要触及组织,以免损伤组织结构,滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡,混匀一抗,否则抗体可能附着不匀。8. 放入湿盒内,置于 4C 冰箱过夜(最长不可超过 48h) ,注意盖盖,放入后观察玻片是否处于水平位(否则抗体可能流失,导致玻片组织

7、干掉,出现背景高和假阳性) ,孵育期间观察抗体是否干,若干了赶快用 PBS 清洗浸泡。9. 第二天上午取出玻片,置常温复温 30min,后 PBS 冲洗 1+5+5+5min,10.滴加 1:100 生物素标记的二抗(注意选择核对一抗来源,抗体加入稀释后在 EP 管内弹匀,掌上离心机离心)室温孵育 30min-1h,后 PBS 冲洗 1+5+5+5min。11.滴加 1:100 比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素 PBS 稀释液(SABC)室温1h,后 PBS 冲洗 1+5+5+5min,甩干,以免显色不均。12.DAB 显色,显色时放置在白色纸上,观察显色程度以终止 DAB 反应,最好

8、把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加 DAB,观察到阳性区和阴性区差异后终止,此时最好有计时,以便于今后重复试验控制显色时间(一般显色时间 2s-10min,显色时间过长背景高,且可靠性低)13.终止 DAB 显色可将玻片置于染色缸内,用自来水流水稀释终止 5min,后在显微镜下观察是否有 DAB 颗粒附着。14.甩干水分,苏木素复染(如为加汞的苏木素,显色时间为 6-10s,可不用酒精分化,直接用 PBS 返蓝,如为非加汞苏木素,需在盐酸酒精分化) ,苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明(75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯 1-二甲苯

9、 2)个3min,滴加中性树胶封片,中性树胶浓度以不拉丝为宜16.封片后干燥 1h(或者在通风橱吹风的情况下 15min),用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。观察照相。针对脱片问题,我做了如下处理。但仍存在脱片现象,麻烦您给我提一些相关的建议。自来水冲洗玻片,晾干后,多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过1. 单涂胶:往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul,用另一张玻片推片,然后叠加其上,停留5分钟,中间推动玻片数次,使液体涂抹均匀,分开两张玻片,滤纸吸干玻片下缘,置玻片架上60 0C烤干1h备用。2. 双涂胶:往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul, 单涂胶60 0C烤干,同样方法重复

10、涂胶1次“ 600C烤干,备用。我用过的尼氏染色的方法,效果不错。1 溶液配制:(1) 溶液 A:焦油固紫 0.2g, 纯水 500ml(2) 溶液 B:0.1M 冰醋酸 冰醋酸 3ml, 纯水 500ml(3) 溶液 C:0.1M 无水醋酸钠 无水醋酸钠 4.1g,纯水 500ml(4) 溶液 D:PH3.54.5 醋酸缓冲液 B 液 94mlC 液 6ml(5) 工作液:A 液 10mlD 液 90ml 过滤后使用,避光保存注:焦油固紫遇光分解,整个过程应避光操作,可以用黑色塑料袋罩着。2 具体步骤: 如果为石蜡切片,先进行脱蜡处理,然后从步骤开始;如果为冰冻切片,从步骤开始。 将凉干的切

11、片放入纯水中 35min 。 切片放入焦油固紫染色液中 11.5h。 切片放入纯水中洗去浮色。 切片放入 70 8095的酒精分色,各几秒钟,时间自己掌握,以不见掉色为好。 切片放入特殊分色液中褪背底(1:1 :1 的无水乙醇,氯仿,乙醚) 。 切片放入 100乙醇,5min3 次;二甲苯 5min3 次,透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。3、结果尼氏小体:深蓝紫色;核、核仁:浅紫色;背底:洁白无色。我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman 甲醇刚果红染色法(类淀粉染色)1、试剂配制:甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.

12、2 g 80%乙醇 100 ml2、染色步骤 :(1)切片脱蜡至水(2)甲醇刚果红染液染 1020 分钟(3)用碱性乙醇分化液分化数秒(4)水洗(5)苏木素复染 2 分钟(6)水洗(7)脱水 ,透明,封固3、结果:淀粉样物呈桔红色。 4、类淀粉染色的应用:确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织,后者在刚果红法染色后呈淡桔色, 冰冻切片脱脂问题:0.5 盐酸乙醇分化液 配置直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎

13、活检、皮肤活检的免疫病理检查。试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4 荧光标记的抗体溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 进行稀释 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml) 有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫) 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37温箱等。实验步骤1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 于待检标本片上,10min 后弃去,使标本保持一定湿度。2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,

14、置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min) 。3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 冲洗后,再按顺序过 0.01mol/L,pH7.4 的PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不时振荡。4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:(-)无荧光;( )极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(+)荧光明亮;(+ -+)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+” 以上,而各种对照显示为()或(- ) ,即可判定为阳性。注意事项1.

15、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过 1:20 ,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从 10 min 到数小时,一般30 min 已足够。染色温度多采用室温(25左右) ,高于 37可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2的低温,延长染色时间。低温染色过夜较 3730 min 效果好的多。3. 为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。(1) 标本自发荧光对照:标本加 1-2 滴 0.01mol/L

16、,pH7.4 的 PBS。(2) 特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。(3) 阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压汞灯下照射超过 3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。免疫荧光的标本制作的基本程序同 DAB 显色的免疫组化:不同的是1 免疫荧光不需要使用双氧水处理,封闭和一抗孵育与其它相同2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定3 二

17、抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油:0.01MPBS (1:1 )5 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中,标本可以保存更久6 荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光87 荧光抗体染色假阳性可能会多,需要设定阳性和阴性对照注意事项1. 荧光染色后一般在 1h 内完成观察,或于 4保存 4h,时间过长 ,会使荧光减弱。2. 每次试验时 ,需设置以下三种对照:(1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物(2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物免疫荧光组织(细胞)化学技术:如何设置对照(直接法、间接法和补体法) http:

18、/cyh(2010-07-28 11:23:08)为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性,排除某些非特异性染色,必须在初次试验时设置对照:1、直接法 (1)标本自发荧光对照标本只加 PBS 或缓冲甘油封片,荧光显微镜观察组织内如果有荧光,称为自发荧光。 (2)抑制试验可分为一步方法和二步方法。一步抑制方法:先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合,再加在标本上染色,结果应为阴性。二步抑制方法:标本先加未标记的特异性抗体,水洗后再加标记荧光抗体,结果应呈阴性或明显减弱的荧光。(3)阳性对照用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色,结果应呈阳性荧光。如对照 1和 2 无荧光或弱荧光,3 待检查

19、标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。2、间接法(1)自发荧光对照:同直接法。(2)荧光抗体对照:标本只加间接荧光抗体染色,结果阴性。(3)抑制试验:同直接法。(4)阳性对照:同直接法。结果:如对照(1)、(2)、(3)均呈阴性,阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。3、补体法(1)自发荧光对照(2)荧光抗体对照(3)抑制试验(4)补体对照:取新鲜豚鼠血清 1:10 稀释,先作用于标本,洗后再用抗补体荧光抗体染色,结果阴性。(5)抑制试验:标本加灭活的第一抗体,再加 1:10 稀释的新鲜豚鼠血清孵育后,再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液,结果应为阴性。(6)阳性对照。(1)(5)结果阴性,(6)待检标本阳性时,则为特异性荧光。

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