凝胶电泳相关知识.docx

1、凝胶电泳（GE）凝 胶 电 泳 （ 英 语 ： Gel electrophoresis） 或 称 胶 体 电 泳 是 一 大 类 技 术 ， 被 科 学工 作 者 用 于 分 离 不 同 物 理 性 质 （ 如 大 小 、 形 状 、 等 电 点 等 ） 的 分 子 。 凝 胶 电 泳 通 常用 于 分 析 用 途 ， 但 也 可 以 作 为 制 备 技 术 ， 在 采 用 某 些 方 法 （ 如 质 谱 (MS)、 聚 合 酶 链式 反 应 (PCR)、 克 隆 技 术 、 DNA 测 序 或 者 免 疫 印 迹 ） 检 测 之 前 部 分 提 纯 分 子 。 该 技术 操 作 简 便 快

2、速 ， 可 以 分 辨 用 其 它 方 法 （ 如 密 度 梯 度 离 心 法 ） 所 无 法 分 离 的 DNA 片段 。 当 用 低 浓 度 的 荧 光 嵌 入 染 料 溴 化 乙 啶 (Ethidium bromide, EB)染 色 ,在 紫 外 光 下至 少 可 以 检 出 1-10ng 的 DNA 条 带 ,从 而 可 以 确 定 DNA 片 段 在 凝 胶 中 的 位 置 。 此 外 ,还 可 以 从 电 泳 后 的 凝 胶 中 回 收 特 定 的 DNA 条 带 ,用 于 以 后 的 克 隆 技 术 操 作 。凝 胶 电 泳 被 广 泛 用 于 分 子 生 物 学 、 遗 传

3、学 和 生 物 化 学 ：1.大 的 DNA 或 者 RNA 分 子 通 常 利 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 （ agarose gel electrophoresis） 分 离 ， 也 可 以 使 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ PAGE） 。 2.蛋 白 质 的 凝 胶 电 泳 通 常 在 加 入 十 二 烷 基 硫 酸 钠 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 进 行 （ SDS-PAGE） ， 或 者 非 变 性 凝 胶 电 泳 ， 或 二 维 电 泳 。 3.毛 细 管 电 泳 4.酶 谱 法 （ zymography） 5.变 性 梯 度 胶 凝 电 泳 （ Dena

4、turing Gradient Gel Electrophoresis， DGGE） 琼 脂 糖 和 聚 丙 烯 酰 胺 可 以 制 成 各 种 形 状 、 大 小 和 孔 隙 度 。 琼 脂 糖 凝 胶 分 离 DNA片 度 大 小 范 围 较 广 ,不 同 浓 度 琼 脂 糖 凝 胶 可 分 离 长 度 从 200bp 至 近 50kb 的 DNA 片 段。 琼 脂 糖 通 常 用 水 平 装 置 在 强 度 和 方 向 恒 定 的 电 场 下 电 泳 。 聚 丙 烯 酰 胺 分 离 小 片 段DNA(5-500bp)效 果 较 好 ,其 分 辩 力 极 高 ,甚 至 相 差 1bp 的

5、DNA 片 段 就 能 分 开 。 聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电 泳 很 快 ,可 容 纳 相 对 大 量 的 DNA,但 制 备 和 操 作 比 琼 脂 糖 凝 胶 困 难 。 聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 采 用 垂 直 装 置 进 行 电 泳 。 目 前 ,一 般 实 验 室 多 用 琼 脂 糖 水 平 平 板 凝 胶 电 泳 装 置进 行 DNA 电 泳 。 琼 脂 糖 主 要 在 DNA 制 备 电 泳 中 作 为 一 种 固 体 支 持 基 质 ,其 密 度 取 决 于 琼 脂 糖 的 浓度 。 在 电 场 中 ,在 中 性 pH 值 下 带 负 电 荷 的 DNA 向 阳 极 迁 移

6、 ,其 迁 移 速 率 由 下 列 多 种 因素 决 定 : 1、 DNA 的 分 子 大 小 : 线 状 双 链 DNA 分 子 在 一 定 浓 度 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 迁 移 速 率 与 DNA 分 子 量 对 数 成反 比 ， 分 子 越 大 则 所 受 阻 力 越 大 ， 也 越 难 于 在 凝 胶 孔 隙 中 蠕 行 ， 因 而 迁 移 得 越 慢 。 2、 琼 脂 糖 浓 度一 个 给 定 大 小 的 线 状 DNA 分 子 ,其 迁 移 速 度 在 不 同 浓 度 的 琼 脂 糖 凝 胶 中 各 不 相 同。 DNA 电 泳 迁 移 率 的 对 数 与 凝 胶 浓 度 成

7、 线 性 关 系 。 凝 胶 浓 度 的 选 择 取 决 于 DNA 分子 的 大 小 。 分 离 小 于 0.5kb 的 DNA 片 段 所 需 胶 浓 度 是 1.2-1.5%,分 离 大 于 10kb 的 DNA 分 子 所 需 胶 浓 度 为 0.3-0.7%, DNA 片 段 大 小 间 于 两 者 之 间 则 所 需 胶 浓 度 为 0.8-1.0%。 3、 DNA 分 子 的 构 象 DNA 分 子 处 于 不 同 构 象 时 ,它 在 电 场 中 移 动 距 离 不 仅 和 分 子 量 有 关 ,还 和 它 本 身构 象 有 关 。 相 同 分 子 量 的 线 状 、 开 环

8、和 超 螺 旋 DNA 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 移 动 速 度 是 不 一样 的 ,超 螺 旋 DNA 移 动 最 快 ,而 开 环 双 链 DNA 移 动 最 慢 。 如 在 电 泳 鉴 定 质 粒 纯 度 时 发现 凝 胶 上 有 数 条 DNA 带 难 以 确 定 是 质 粒 DNA 不 同 构 象 引 起 还 是 因 为 含 有 其 他 DNA引 起 时 ,可 从 琼 脂 糖 凝 胶 上 将 DNA 带 逐 个 回 收 ,用 同 一 种 限 制 性 内 切 酶 分 别 水 解 ,然 后电 泳 ,如 在 凝 胶 上 出 现 相 同 的 DNA 图 谱 ,则 为 同 一 种 DNA。

9、4、 电 源 电 压 在 低 电 压 时 ,线 状 DNA 片 段 的 迁 移 速 率 与 所 加 电 压 成 正 比 。 但 是 随 着 电 场 强 度 的增 加 ， 不 同 分 子 量 的 DNA 片 段 的 迁 移 率 将 以 不 同 的 幅 度 增 长 ,片 段 越 大 ,因 场 强 升 高引 起 的 迁 移 率 升 高 幅 度 也 越 大 ,因 此 电 压 增 加 ， 琼 脂 糖 凝 胶 的 有 效 分 离 范 围 将 缩 小 。 要使 大 于 2kb 的 DNA 片 段 姆 直 媛 蚀 锏 阶 畲 ?所 加 电 压 不 得 超 过 5V/cm。 5、 嵌 入 染 料 的 存 在 荧

10、 光 染 料 溴 化 乙 啶 用 于 检 测 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 DNA,染 料 会 嵌 入 到 堆 积 的 碱 基 对 之间 并 拉 长 线 状 和 带 缺 口 的 环 状 DNA， 使 其 刚 性 更 强 ,还 会 使 线 状 DNA 迁 移 率 降 低 15 。 6、 离 子 强 度 影 响 电 泳 缓 冲 液 的 组 成 及 其 离 子 强 度 影 响 DNA 的 电 泳 迁 移 率 。 在 没 有 离 子 存 在 时 (如 误 用 蒸 馏 水 配 制 凝 胶 ),电 导 率 最 小 ,DNA 几 乎 不 移 动 ,在 高 离 子 强 度 的 缓 冲 液 中 (如误 加 10电

11、 泳 缓 冲 液 ),则 电 导 很 高 并 明 显 产 热 ,严 重 时 会 引 起 凝 胶 熔 化 或 DNA 变 性 。 对 于 天 然 的 双 链 DNA,常 用 的 几 种 电 泳 缓 冲 液 有 TAE含 EDTA (pH8.0)和 Tris-乙 酸 ,TBE(Tris-硼 酸 和 EDTA),TPE(Tris-磷 酸 和 EDTA),一 般 配 制 成 浓 缩 母 液 ,储 于 室温 。 密度梯度离心法 http:/ http:/ DNA琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳是分子克隆的核心技术之一,它用于分离,鉴定和纯化 DNA 片段,该技术操作简单而迅速,并且能分离用其它方法如密度梯度离心等

12、不能满意分离的 DNA片段。在分子生物学实验中,很多情况需要利用琼脂糖凝胶电泳观察、纯化和回收 DNA 片断,特别是在进行基因的预测、筛选、克隆和转化及不同类型 DNA 分子标记之间的转换中,对所研究的目的 DNA 片断进行纯化和回收,然后克隆和测序 ,需要准确、简便、快速、经济的琼脂糖凝胶 DNA 片段回收方法。其方法已有较多报道 ,如 DEAE-纤维素膜电泳法、透析袋电洗脱法、低融点琼脂糖凝胶法、凝胶冻融法及挖孔法等，不同的方法有不同的优缺点（有时候非常赞叹人们的智慧，什么方法都能想得出来，本来科学就是在发现问题和解决问题的过程中不断发展的） ，现在介绍一种比较简单的方法：材料1. 5 m

13、L 微量离心管, lmL 取液吸头 , 300 目尼龙网膜，透析膜 , 镊子, 单面刀片, 解剖刀方法按图所示, 先将 1.5 mL 微量离心管盖的塞圈用单面刀片截下, 可以通过调整此圈的保留高度而改变回收腔的体积 L 将管身下部截去, 以便通电流。将双层透析膜蒙在塞圈上, 将 lmL 吸头的大头推入微量离心管一定深度, 以便管口能有力地卡住负极部，多余的透析膜用解剖刀划去。将 lmL 吸头的尖端截去，用镊子夹住烧红的刀片在 t ip 管上切出一方孔，剪适当大小的一块尼龙网膜, 用以蒙住 tip 管的大口端，将正极部、负极部和尼龙网膜均沟在 1TBE 电泳缓冲液中, 煮沸 10 min, 以活

14、化透析膜并去除一些可能的干扰杂质。将装置拿出来, 将含目的 DNA 的琼脂糖凝胶从方孔装人负极部; 往回收腔中注满 1TBE 缓冲液, 然后将蒙上尼龙网膜的负极部塞入正极部, 将整个装置按图所示的方向浸入水平电泳槽中电泳 (方孔朝上) ，槽中电泳缓冲液应刚好没过回收装置。注意在整个回收装置中切勿留有气泡, 尤其是回收腔中电泳时电压降一般为 1-5V/cm , 电泳时间一般为 0. 5 4 h。电泳完了之后, 拆下负极部, 用取液器将回收腔中的回收液吹打几次, 移入微量离心管 , 加入等体积的 pH 7. 8、T ris 饱和苯酚与氯仿混合物(体积比 11) , 振荡以除去 DNA 中的溴乙锭(

15、EB) 。微量离心机 6 000 r/m in 离心 5 min, 同时可除去残留的琼脂糖凝胶。上清中加入 1/20 体积的 pH 5. 2、3. 0mol/L的 NaAc, 混匀 , 然后加入 2 倍体积、4预冷的无水乙醇, 混匀, 冰上放置 10min 于 4微量离心机上 12 000 r/min 离心 10min。去上清, 沉淀以 70% 酒精洗涤, 稍加离心, 尽量将上清去除干净, 真空干燥 2min，所得 DNA 溶于一定量的 pH 8. 0 的 TE 中或去离子灭菌水中溴化乙锭（EB）分 子 式 ： C21H20BrN3 英 文 名 ： Ethidium bromide 分 子 量

16、 ： 394.3139 g/mol 熔 点 ： 260 - 262 C 为 芳 香 族 荧 光 化 合 物EB（ Ethidium bromide， 溴 化 乙 锭 ）溴 化 乙 锭 是 一 种 高 度 灵 敏 的 荧 光 染 色 剂 ， 用 于 观 察 琼 脂 糖 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 的 DNA。 溴 化 乙 锭 用 标 准 302nm 紫 外 光 透 射 仪 激 发 并 放 射 出 橙 红 色 信 号 ， 可 用 Polaroid 底 片 或 带 CCD 成 像 头 的 凝 胶 成 像 处 理 系 统 拍 摄 。溴 化 乙 锭 可 以 嵌 入 碱 基 分 子 中 ,导 致

17、错 配 。 溴 化 乙 锭 是 强 诱 变 剂 ,具 有 高 致 癌 性 ! 普 通 实 验 手 套 （ 浅 黄 色 乳 胶 手 套 ） 不 能 很 好 的 阻 挡 EB， 最 好 用 蓝 色 实 验 用 手 套 。观 察 琼 脂 糖 凝 胶 中 DNA 最 常 用 的 方 法 是 利 用 荧 光 染 料 溴 化 乙 锭 进 行 染 色 ， 溴 化 乙锭 含 有 一 个 可 以 嵌 入 DNA 堆 积 碱 基 之 间 的 一 个 三 环 平 面 基 团 。 它 与 DNA 的 结 合 几乎 没 有 碱 基 序 列 特 异 性 。 在 高 离 子 强 度 的 饱 和 溶 液 中 ， 大 约 每

18、2.5 个 碱 基 插 入 一 个 溴化 乙 锭 分 子 。 当 染 料 分 子 插 入 后 ， 其 平 面 基 团 与 螺 旋 的 轴 线 垂 直 并 通 过 范 德 华 力 与 上 下碱 基 相 互 作 用 。 这 个 基 团 的 固 定 位 置 及 其 与 碱 基 的 密 切 接 近 ， 导 致 与 DNA 结 合 的 染料 呈 现 荧 光 ， 其 荧 光 产 率 比 游 离 溶 液 中 染 料 有 所 增 加 。 DNA 吸 收 254nm 处 的 紫 外 辐射 并 传 递 给 染 料 ， 而 被 结 合 的 染 料 本 身 吸 收 302nm 和 366nm 的 光 辐 射 。 这

19、两 种 情 况下 ， 被 吸 收 的 能 量 在 可 见 光 谱 红 橙 区 的 590nm 处 重 新 发 射 出 来 。 由 于 溴 化 乙 锭 -DNA 复 合 物 的 荧 光 产 率 比 没 有 结 合 DNA 的 染 料 高 出 20-30 倍 ， 所 以 当 凝 胶 中 含 有 游 离的 溴 化 乙 锭 （ 0.5ug/ml） 时 ， 可 以 检 测 到 少 至 10ng 的 DNA 条 带 。溴 化 乙 锭 可 以 用 来 检 测 单 链 或 双 链 核 酸 （ DNA 或 RNA） 。 但 是 染 料 对 单 链 核 酸 的亲 和 力 相 对 较 小 ， 所 以 其 荧 光 产

20、 率 也 相 对 较 低 。 事 实 上 ， 大 多 数 对 单 链 DNA 或 RNA 染 色 的 荧 光 时 通 过 染 料 结 合 到 分 子 内 形 成 较 短 的 链 内 螺 旋 产 生 的 。尽 管 在 该 染 料 存 在 的 情 况 下 ， 线 状 DNA 的 电 泳 迁 移 率 约 降 低 15%， 因 此 ， 当 需要 知 道 DNA 片 段 的 准 确 大 小 （ 如 DNA 限 制 酶 酶 切 图 谱 的 鉴 定 ） ， 凝 胶 应 该 在 无 EB情 况 下 电 泳 ， 电 泳 结 束 后 用 EB 染 色 。 染 色 完 毕 后 ， 通 常 不 需 要 脱 色 。 但

21、 是 在 检 测 小量 DNA（ 小 于 10ng） 片 段 时 ， 通 常 要 将 染 色 后 的 凝 胶 进 行 脱 色 。溴 化 乙 锭 的 损 害 溴 化 乙 锭 可 以 嵌 入 碱 基 分 子 中 ， 导 致 错 配 。 溴 化 乙 锭 是 强 诱 变 剂 ， 具 有 高 致 癌 性 ！ SYBR Green I 和 溴 化 乙 啶 （ EB） Ames 测 试 结 果 显 示 EB 容 易 引 起 有 机 体 突 变 。(Singer et al., Mutat. Res. 199, 439: 37- 47.) 溴 化 乙 锭 溶 液 的 净 化 处 理 由 于 溴 化 乙 锭 具

22、 有 一 定 的 毒 性 ， 实 验 结 束 后 ， 应 对 含 EB 的 溶 液 进 行 净 化 处 理 再行 弃 置 ， 以 避 免 污 染 环 境 和 危 害 人 体 健 康 。(1) 对 于 EB 含 量 大 于 0.5mg/ml 的 溶 液 ， 可 如 下 处 理 ： 将 EB 溶 液 用 水 稀 释 至 浓 度 低 于 0.5mg/ml； 加 入 一 倍 体 积 的 0.5mol/L KMnO4， 混 匀 ， 再 加 入 等 量 的 25mol/L HCl， 混 匀， 置 室 温 数 小 时 ； 加 入 一 倍 体 积 的 2.5mol/L NaOH， 混 匀 并 废 弃 。(2)

23、 EB 含 量 小 于 0.5mg/ml 的 溶 液 可 如 下 处 理 ： 按 1mg/ml 的 量 加 入 活 性 炭 ， 不 时 轻 摇 混 匀 ， 室 温 放 置 1 小 时 ； 用 滤 纸 过 滤 并 将 活 性 碳 与 滤 纸 密 封 后 丢 弃 。PCR（聚合酶链式反应）聚 合 酶 链 式 反 应 (Polymerase Chain Reaction)， 简 称 PCR， 是 一 种 分 子 生 物 学技 术 ， 用 于 放 大 特 定 的 DNA 片 段 。 可 看 作 生 物 体 外 的 特 殊 DNA 复 制 。DNA 聚 合 酶 （ DNApolymerase I） 最

24、早 于 1955 年 发 现 ， 而 较 具 有 实 验 价 值 及 实用 性 的 Klenow fragment of E. Coli 则 是 于 70 年 代 的 初 期 由 Dr. H. Klenow 所 发现 ， 但 由 于 此 酶 不 耐 高 温 ， 高 温 能 使 之 变 性 ,因 此 不 符 合 使 用 高 温 变 性 的 聚 合 酶 链 式 反应 。 现 今 所 使 用 的 酶 (简 称 Taq polymerase), 则 是 于 1976 年 从 温 泉 中 的 细 菌 （ Thermusaquaticus） 分 离 出 来 的 。 它 的 特 性 就 在 于 能 耐 高

25、温 ， 是 一 个 很 理 想 的 酶 ， 但 它 被广 泛 运 用 则 于 80 年 代 之 后 。 PCR 最 初 的 原 始 雏 形 概 念 是 类 似 基 因 修 复 复 制 ， 它 是 于 1971 年 由 Dr. Kjell Kleppe 提 出 。 他 发 表 了 第 一 个 单 纯 且 短 暂 性 基 因 复 制 （ 类 似 PCR 前 两 个 周 期 反 应 ） 的 实 验 。 而 现 今 所 发 展 出 来 的 PCR 则 于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 发 展 出 的 ， Dr. Mullis 当 年 服 务 于 PE 公 司 ， 因 此 PE 公

26、 司 在 PCR 界 有 着 特 殊的 地 位 。 Dr. Mullis 并 于 1985 年 与 Saiki 等 人 正 式 发 表 了 第 一 篇 相 关 的 论 文 。 此 后 ，PCR 的 运 用 一 日 千 里 ， 相 关 的 论 文 发 表 质 量 可 以 说 是 令 众 多 其 它 研 究 方 法 难 望 其 项 背。 随 后 PCR 技 术 在 生 物 科 研 和 临 床 应 用 中 得 以 广 泛 应 用 ， 成 为 分 子 生 物 学 研 究 的 最 重要 技 术 。 Mullis 也 因 此 获 得 了 1993 年 诺 贝 尔 化 学 奖 。 PCR 原 理 DNA 的

27、 半 保 留 复 制 是 生 物 进 化 和 传 代 的 重 要 途 径 。 双 链 DNA 在 多 种 酶 的 作 用 下可 以 变 性 解 链 成 单 链 ， 在 DNA 聚 合 酶 的 参 与 下 ， 根 据 碱 基 互 补 配 对 原 则 复 制 成 同 样 的两 分 子 挎 贝 。 在 实 验 中 发 现 ， DNA 在 高 温 时 也 可 以 发 生 变 性 解 链 ， 当 温 度 降 低 后 又 可以 复 性 成 为 双 链 。 因 此 ， 通 过 温 度 变 化 控 制 DNA 的 变 性 和 复 性 ， 加 入 设 计 引 物 ， DNA 聚 合 酶 、 dNTP 就 可 以

28、 完 成 特 定 基 因 的 体 外 复 制 。但 是 ， DNA 聚 合 酶 在 高 温 时 会 失 活 ， 因 此 ， 每 次 循 环 都 得 加 入 新 的 DNA 聚 合 酶， 不 仅 操 作 烦 琐 ， 而 且 价 格 昂 贵 ， 制 约 了 PCR 技 术 的 应 用 和 发 展 。发 现 耐 热 DNA 聚 合 酶 -Taq 酶 对 于 PCR 的 应 用 有 里 程 碑 的 意 义 ， 该 酶 可 以 耐 受 90 以 上 的 高 温 而 不 失 活 ， 不 需 要 每 个 循 环 加 酶 ， 使 PCR 技 术 变 得 非 常 简 捷 、 同 时 也大 大 降 低 了 成 本

29、 ， PCR 技 术 得 以 大 量 应 用 ， 并 逐 步 应 用 于 临 床 。PCR 技 术 的 基 本 原 理 类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 ， 其 特 异 性 依 赖 于 与 靶 序 列 两端 互 补 的 寡 核 苷 酸 引 物 。 PCR 由 变 性 -退 火 -延 伸 三 个 基 本 反 应 步 骤 构 成 ： 模 板 DNA 的 变 性 ： 模 板 DNA 经 加 热 至 93 左 右 一 定 时 间 后 ， 使 模 板 DNA 双 链 或 经 PCR扩 增 形 成 的 双 链 DNA 解 离 ， 使 之 成 为 单 链 ， 以 便 它 与 引 物 结 合 ，

30、 为 下 轮 反 应 作 准 备 ； 模 板 DNA 与 引 物 的 退 火 (复 性 )： 模 板 DNA 经 加 热 变 性 成 单 链 后 ， 温 度 降 至 55左 右 ， 引 物 与 模 板 DNA 单 链 的 互 补 序 列 配 对 结 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA 模 板 -引 物结 合 物 在 TaqDNA 聚 合 酶 的 作 用 下 ， 以 dNTP 为 反 应 原 料 ， 靶 序 列 为 模 板 ， 按 碱 基 互补 配 对 与 半 保 留 复 制 原 理 ， 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 互 补 的 半 保 留 复 制 链 ， 重 复循 环 变

31、 性 -退 火 -延 伸 三 过 程 就 可 获 得 更 多 的 “半 保 留 复 制 链 ”， 而 且 这 种 新 链 又 可 成 为下 次 循 环 的 模 板 。 每 完 成 一 个 循 环 需 2 4 分 钟 ， 2 3 小 时 就 能 将 待 扩 目 的 基 因 扩 增放 大 几 百 万 倍 。 PCR 反 应 体 系 与 反 应 条 件 标 准 的 PCR 反 应 体 系 10扩增缓冲液 10l 4 种 dNTP 混合物 200l 引物 10100l 模板 DNA 0.12g Taq DNA 聚合酶 2.5 l Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水 100 l PCR 反 应

32、五 要 素 ： 参 加 PCR 反 应 的 物 质 主 要 有 五 种 即 引 物 (PCR 引 物 为 DNA片 段 ， 细 胞 内 DNA 复 制 的 引 物 为 一 段 RNA 链 )、 酶 、 dNTP、 模 板 和 缓 冲 液 （ 其 中需 要 Mg2+)。 PCR 步 骤 标 准 的 PCR 过 程 分 为 三 步 ：1.DNA 变 性 （ 90 -96 ） ： 双 链 DNA 模 板 在 热 作 用 下 ， 氢 键 断 裂 ， 形 成 单 链DNA2.退 火 （ 25 -65 ） ： 系 统 温 度 降 低 ， 引 物 与 DNA 模 板 结 合 ， 形 成 局 部 双 链 。3

33、.延 伸 （ 70 -75 ） ： 在 Taq 酶 （ 在 72 左 右 ， 活 性 最 佳 ） 的 作 用 下 ， 以 dNTP 为 原 料 ， 从 引 物 的 5端 3端 延 伸 ， 合 成 与 模 板 互 补 的 DNA 链 。每 一 循 环 经 过 变 性 、 退 火 和 延 伸 ， DNA 含 量 即 增 加 一 倍 。 如 图 所 示 ：现 在 有 些 PCR 因 为 扩 增 区 很 短 ， 即 使 Taq 酶 活 性 不 是 最 佳 也 能 在 很 短 的 时 间 内复 制 完 成 ， 因 此 可 以 改 为 两 步 法 ， 即 退 火 和 延 伸 同 时 在 60 -65 间

34、进 行 ， 以 减 少 一次 升 降 温 过 程 ， 提 高 了 反 应 速 度 。 PCR 检 测 PCR 反 应 扩 增 出 了 高 的 拷 贝 数 ， 下 一 步 检 测 就 成 了 关 键 。 荧 光 素 （ 溴 化 乙 锭 ，EB） 染 色 凝 胶 电 泳 是 最 常 用 的 检 测 手 段 。 电 泳 法 检 测 特 异 性 是 不 太 高 的 ， 因 此 引 物 两聚 体 等 非 特 异 性 的 杂 交 体 很 容 易 引 起 误 判 。 但 因 为 其 简 捷 易 行 ， 成 为 了 主 流 检 测 方 法 。近 年 来 以 荧 光 探 针 为 代 表 的 检 测 方 法 ，

35、有 逐 渐 取 代 电 泳 法 的 趋 势 。 PCR 反 应 特 点 特 异 性 强PCR 反 应 的 特 异 性 决 定 因 素 为 ： 引 物 与 模 板 DNA 特 异 正 确 的 结 合 ； 碱 基 配 对 原 则 ； Taq DNA 聚 合 酶 合 成 反 应 的 忠 实 性 ； 靶 基 因 的 特 异 性 与 保 守 性 。其 中 引 物 与 模 板 的 正 确 结 合 是 关 键 。 引 物 与 模 板 的 结 合 及 引 物 链 的 延 伸 是 遵 循 碱 基配 对 原 则 的 。 聚 合 酶 合 成 反 应 的 忠 实 性 及 TaqDNA 聚 合 酶 耐 高 温 性 ，

36、使 反 应 中 模 板 与引 物 的 结 合 (复 性 )可 以 在 较 高 的 温 度 下 进 行 ， 结 合 的 特 异 性 大 大 增 加 ， 被 扩 增 的 靶 基 因片 段 也 就 能 保 持 很 高 的 正 确 度 。 再 通 过 选 择 特 异 性 和 保 守 性 高 的 靶 基 因 区 ， 其 特 异 性 程度 就 更 高 。灵 敏 度 高PCR 产 物 的 生 成 量 是 以 指 数 方 式 增 加 的 ， 能 将 皮 克 (pg=10-12)量 级 的 起 始 待 测模 板 扩 增 到 微 克 (g=-6)水 平 。 能 从 100 万 个 细 胞 中 检 出 一 个 靶

37、细 胞 ； 在 病 毒 的 检 测 中， PCR 的 灵 敏 度 可 达 3 个 RFU(空 斑 形 成 单 位 )； 在 细 菌 学 中 最 小 检 出 率 为 3 个 细 菌。简 便 、 快 速PCR 反 应 用 耐 高 温 的 Taq DNA 聚 合 酶 ， 一 次 性 地 将 反 应 液 加 好 后 ， 即 在 DNA扩 增 液 和 水 浴 锅 上 进 行 变 性 -退 火 -延 伸 反 应 ， 一 般 在 2 4 小 时 完 成 扩 增 反 应 。 扩 增产 物 一 般 用 电 泳 分 析 ， 不 一 定 要 用 同 位 素 ， 无 放 射 性 污 染 、 易 推 广 。对 标 本

38、的 纯 度 要 求 低不 需 要 分 离 病 毒 或 细 菌 及 培 养 细 胞 ， DNA 粗 制 品 及 RNA 均 可 作 为 扩 增 模 板 。可 直 接 用 临 床 标 本 如 血 液 、 体 腔 液 、 洗 嗽 液 、 毛 发 、 细 胞 、 活 组 织 等 DNA 扩 增 检 测。 PCR 的 循 环 参 数 1、 预 变 性 （ Initial denaturation） 模 板 DNA 完 全 变 性 对 PCR 能 否 成 功 至 关 重 要 ， 一 般 95 加 热 3-5 分 钟 。2、 引 物 退 火 （ Primer annealing）退 火 温 度 一 般 需

39、要 凭 实 验 （ 经 验 ） 决 定 ， 一 般 为 54 。退 火 温 度 对 PCR 的 特 异 性 有 较 大 影 响 。3、 引 物 延 伸引 物 延 伸 一 般 在 72 进 行 （ Taq 酶 最 适 温 度 ） 。延 伸 时 间 随 扩 增 片 段 长 短 而 定 。4、 循 环 中 的 变 性 步 骤循 环 中 一 般 95 ， 30 秒 足 以 使 各 种 靶 DNA 序 列 完 全 变 性 ：变 性 时 间 过 长 损 害 酶 活 性 ， 过 短 靶 序 列 变 性 不 彻 底 ， 易 造 成 扩 增 失 败 。5、 循 环 数大 多 数 PCR 含 25-35 循 环

40、， 过 多 易 产 生 非 特 异 扩 增 。6、 最 后 延 伸在 最 后 一 个 循 环 后 ， 反 应 在 72 维 持 5-15 分 钟 使 引 物 延 伸 完 全 ， 并 使 单 链 产物 退 火 成 双 链 。（ 四 ） PCR 中 的 污 染 和 假 阳 性PCR 中 污 染 主 要 来 自1、 样 品 间 交 叉 污 染 ；2、 先 前 PCR 产 物 遗 留 （ carry-over） PCR 仪 器 pcr 仪 器 的 发 展pcr 温 度 循 环 至 关 重 要 ， pcr 扩 增 仪 各 参 数 必 须 准 确 。 自 perkin elmercetus 公司 第 一

41、台 pcr 扩 增 仪 问 世 以 来 ， 现 已 有 几 十 家 不 同 的 厂 家 在 国 内 外 生 产 和 销 售 pcr扩 增 仪 。 在 短 短 的 几 年 间 ， 扩 增 仪 经 过 几 代 的 发 展 ， 不 断 采 用 新 技 术 ， 并 且 进 一 步 朝 方便 、 实 用 、 高 智 能 化 和 自 动 化 的 方 向 发 展 。为 了 便 于 了 解 和 选 购 适 宜 的 pcr 实 验 设 备 ， 现 将 部 分 国 内 外 pcr 扩 增 仪 列 表 如 下； 这 些 仪 器 主 要 用 变 温 铝 块 、 变 温 水 浴 及 变 温 气 流 的 方 式 达 到

42、热 循 环 的 目 的 ， 各 有 其 优缺 点 。 国 产 1109 型 dna 扩 增 仪 则 是 用 恒 温 浴 机 械 手 移 位 式 。 更 接 近 于 手 工 操 作 。 ptc-51a/b 体 积 小 ， 智 能 化 与 自 动 化 程 序 高 ， 可 以 兼 做 套 式 pcr， 方 便 实 用 。 以 上 各 种仪 器 一 般 都 配 有 微 电 脑 自 动 控 制 温 度 、 时 间 及 循 环 数 ， 可 以 达 到 节 省 劳 动 力 的 目 的 。 在采 用 这 些 仪 器 作 pcr 试 验 之 前 ， 一 般 均 应 实 测 管 内 温 度 变 化 循 环 情 况

43、 ， 以 了 解 升 、 降温 时 管 内 因 热 传 导 造 成 的 温 度 滞 后 情 况 和 实 际 到 达 的 最 高 、 最 低 温 度 ， 用 于 修 正 设 计 的循 环 参 数 。 温 度 滞 后 受 到 所 用 eppendorf 管 材 料 、 壁 厚 及 形 状 （ 与 铝 块 孔 匹 配 程 度 ）的 影 响 ， 这 对 变 温 铝 块 式 仪 器 影 响 更 大 些 。 对 于 配 用 制 冷 机 式 半 导 体 元 件 致 冷 的 仪 器 ，在 使 用 低 于 室 温 的 温 度 来 保 冷 pcr 反 应 后 小 管 时 ， 应 注 意 冷 凝 水 的 问 题 ，

44、 勿 使 流 入 仪器 内 浸 湿 半 导 体 元 件 而 损 坏 仪 器 。 PCR 常 见 问 题 PCR 产 物 的 电 泳 检 测 时 间一 般 为 48h 以 内 ， 有 些 最 好 于 当 日 电 泳 检 测 ， 大 于 48h 后 带 型 不 规 则 甚 至 消 失。 假 阴 性 ， 不 出 现 扩 增 条 带PCR 反 应 的 关 键 环 节 有 模 板 核 酸 的 制 备 ， 引 物 的 质 量 与 特 异 性 ， 酶 的 质量 及 ， PCR 循 环 条 件 。 寻 找 原 因 亦 应 针 对 上 述 环 节 进 行 分 析 研 究 。模 板 ： 模 板 中 含 有 杂 蛋

45、 白 质 ， 模 板 中 含 有 Taq 酶 抑 制 剂 ， 模 板 中 蛋 白 质没 有 消 化 除 净 ， 特 别 是 染 色 体 中 的 组 蛋 白 ， 在 提 取 制 备 模 板 时 丢 失 过 多 ， 或 吸 入 酚。 模 板 核 酸 变 性 不 彻 底 。 在 酶 和 引 物 质 量 好 时 ， 不 出 现 扩 增 带 ， 极 有 可 能 是 标 本 的 消化 处 理 ， 模 板 核 酸 提 取 过 程 出 了 毛 病 ， 因 而 要 配 制 有 效 而 稳 定 的 消 化 处 理 液 ， 其 程 序 亦应 固 定 不 宜 随 意 更 改 。酶 失 活 ： 需 更 换 新 酶 ，

46、或 新 旧 两 种 酶 同 时 使 用 ， 以 分 析 是 否 因 酶 的 活 性 丧 失 或 不 够而 导 致 假 阴 性 。 需 注 意 的 是 有 时 忘 加 Taq 酶 或 溴 乙 锭 。引 物 ： 引 物 质 量 、 引 物 的 浓 度 、 两 条 引 物 的 浓 度 是 否 对 称 ， 是 PCR 失 败 或 扩 增条 带 不 理 想 、 容 易 弥 散 的 常 见 原 因 。 有 些 批 号 的 引 物 合 成 质 量 有 问 题 ， 两 条 引 物 一 条 浓度 高 ， 一 条 浓 度 低 ， 造 成 低 效 率 的 不 对 称 扩 增 ， 对 策 为 ： 选 定 一 个 好

47、的 引 物 合 成 单位 。 引 物 的 浓 度 不 仅 要 看 OD 值 ， 更 要 注 重 引 物 原 液 做 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 一 定 要 有引 物 条 带 出 现 ， 而 且 两 引 物 带 的 亮 度 应 大 体 一 致 ， 如 一 条 引 物 有 条 带 ， 一 条 引 物 无 条 带， 此 时 做 PCR 有 可 能 失 败 ， 应 和 引 物 合 成 单 位 协 商 解 决 。 如 一 条 引 物 亮 度 高 ， 一 条 亮度 低 ， 在 稀 释 引 物 时 要 平 衡 其 浓 度 。 引 物 应 高 浓 度 小 量 分 装 保 存 ， 防 止 多 次 冻 融 或

48、长 期 放 冰 箱 冷 藏 部 分 ， 导 致 引 物 变 质 降 解 失 效 。 引 物 设 计 不 合 理 ， 如 引 物 长 度 不 够， 引 物 之 间 形 成 二 聚 体 等 。Mg2+浓 度 ： Mg2+离 子 浓 度 对 PCR 扩 增 效 率 影 响 很 大 ， 浓 度 过 高 可 降 低 PCR扩 增 的 特 异 性 ， 浓 度 过 低 则 影 响 PCR 扩 增 产 量 甚 至 使 PCR 扩 增 失 败 而 不 出 扩 增 条带 。反 应 体 积 的 改 变 ： 通 常 进 行 PCR 扩 增 采 用 的 体 积 为 20ul、 30ul、 50ul。 或 100ul，

49、应 用 多 大 体 积 进 行 PCR 扩 增 ， 是 根 据 科 研 和 临 床 检 测 不 同 目 的 而 设 定 ， 在 做 小体 积 如 20ul 后 ， 再 做 大 体 积 时 ， 一 定 要 模 索 条 件 ， 否 则 容 易 失 败 。物 理 原 因 ： 变 性 对 PCR 扩 增 来 说 相 当 重 要 ， 如 变 性 温 度 低 ， 变 性 时 间 短 ， 极 有 可能 出 现 假 阴 性 ;退 火 温 度 过 低 ， 可 致 非 特 异 性 扩 增 而 降 低 特 异 性 扩 增 效 率 退 火 温 度 过 高影 响 引 物 与 模 板 的 结 合 而 降 低 PCR 扩 增 效 率 。 有 时 还 有 必 要 用 标 准