出口食品_副溶血性弧菌_检验.doc

1、MM_FS_CNJ_0337 出口食品 副溶血性弧菌 检验MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌检验方法1.适用范围本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。2.主要试剂和仪器2.1.主要试剂（包括培养基）30gL 氯化钠稀释液：见 6.1；60gL 氯化钠蛋白胨水（PW）：见 6.2；氯化钠多粘菌素 B 肉汤（SPB）：见 6.3；硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）：见 6.4；氯化钠三糖铁琼脂（TSI）：见 6.5；嗜盐性试验用胰胨水（TB）：见 6.6；胰胨大豆琼脂斜面（TSA）：见 6.7；靛基质试验用培养基（I）：见 6.8；氨基酸试验用培养

2、基：见 6.9；VP 半固体琼脂（VP）：见 6.10；糖类分解试验用培养基：见 6.11；42生长试验用培养基：见 6.12；OF 试验用培养基（HLGB）：见 6.13；神奈川现象试验用我妻氏琼脂（WA）：见 6.14。2.2.仪器试管：17mm170mm、15mm150mm、10mm100mm；吸管：1mL、10mL；培养皿：直径 90mm；广口瓶或三角瓶；电动均质器；电动试管振荡器；37恒温箱；42恒温水浴箱；试管架。3.过程简述3.1.样品制备3.1.1.冷冻样品应在 45以下不超过 15min 或在 25不超过 18h 解冻。若不能及时检验，应放于15左右保存；非冷冻而易腐的样品应

3、尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于 610冰箱保存，在 24h 内检验。3.1.2.取样：以无菌操作进行。3.1.2.1.鱼类：取鱼体不同部位。3.1.2.2.贝类：取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类，则应先在清洁的流水中洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。3.1.2.3.甲壳类：取包括鳃及肠的部分或整体。3.1.3.以无菌操作称取 50g 检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。3.1.4.加 30gL 氯化钠稀释水 450mL，均质（8000rmin）1min，使成 110稀释液（如无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加 450mL 稀释水使成 110 稀

4、释液，并充分振荡）。3.1.5.用 1mL 灭菌吸管吸取 110 稀释液 1mL，注入装有 9mL30gL 氯化钠稀释水的试管内，振摇试管混合均匀，制成 1100 稀释液。3.1.6.每一稀释度换取 1 支 1mL 灭菌吸管，按上项操作顺序进行 10 倍递增稀释。稀释倍数要依据有关标准、规定、要求或样品污染情况而定。3.2.增菌培养和分离3.2.1.对新鲜样品，可选择 3 个连续适宜的稀释度，分别以 1mL 无菌吸管各吸取 1mL 稀释液，接种 10mL 单料氯化钠多粘菌素 B 肉汤中，进行选择性增菌培养，每一稀释度接种 3 管（若选择的稀释度为接种 1g 样品时，则应以 10mL 灭菌吸管吸

5、取 110 稀释液 10mL，接种 10mL 双料氯化钠多粘菌素 B 肉汤中）。对经加热、辐射处理或冷藏、冻结的样品，可按以上操作先将样品接种于60gL 氯化钠蛋白胨水于 37前增菌 1824h，然后将培养物以接种环转种到氯化钠多粘菌素 B 肉汤中进行选择性增菌。3.2.2.37培养 1824h。3.2.3.氯化钠多粘菌素 B 肉汤管如有菌生长，则以 3mm 直径接种环分别取一环菌液，划线于硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）平板上。3.2.4.37培养 1824h。3.2.5.副溶血性弧菌在蔗糖琼脂（TCBS）平板上的典型菌落呈圆形，边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明，多数具尖心、斗

6、笠状，蓝绿色菌落，直么 24mm。3.3.生化鉴定3.3.1.在蔗糖琼脂（TCBS）平板上如出现典型或可疑菌落，每个平板至少挑取两个菌落，每个菌落分别顺次接种到下列培养基进行鉴别试验。3.3.1.1.无盐胰胨水。3.3.1.2.30gL 氯化钠胰胨水。3.3.1.3.氯化钠三糖铁琼脂：先穿刺后划线。3.3.2.37培养 1824h。3.3.3.选取在氯化钠三糖铁斜面上产碱，在底层产酸，不产气，不产硫化氢；在无盐胰胨水中几乎不生长；在 30gL 氯化钠胰胨水中生长旺盛的菌株进行革兰氏染色，镜检，副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，两端浓染、无芽胞。如符合，继续进行以下生化鉴定

7、。3.3.3.1.嗜盐性试验：各取一环 30gL 氯化钠胰胨水培养物，分别接种到70gL 及 100gL 氯化钠胰胨水中，37培养 1824h。3.3.3.2.细胞色素氧化酶试验：取一环 30gL 氯化钠胰胨水培养物划线到胰胨大豆琼脂斜面上，37培养 1824h。3.3.3.3.靛基质试验：在 3.3.1.2 的 30gL 氯化钠胰胨水培养物中加靛基质试剂后观察反应。3.3.3.4.赖氨酸脱羧酶试验：由氯化钠三糖铁斜面以接种针取少许培养物接种到赖氨酸试验用培养基中，37培养 1824h。3.3.3.5.精氨酸双水解酶试验：按上项同样操作，将培养物接种到精氨酸试验用培养基中，37培养 1824h

8、。3.3.3.6.VP 试验：以接种针由氯化钠三糖铁斜面取少许培养物穿刺 VP 半固体琼脂，37培养 1824h。在加 VP 试剂前应先观察动力。沿穿刺线周围呈扩散性生长为动力阳性。3.3.4.副溶血性弧菌生化特性的判定及进一步试验如下。3.3.4.1.如所分离的菌株符合表 1 特性，按第 7 章报告结果。表 1.副溶血性弧菌的生化特性鉴 定 程 序 生 化 项 目 反 应氯化钠三糖铁斜面 产碱底层 产酸，不产气硫化氢 阴性嗜盐性无盐胰胨水 几乎不生长初筛30gL 氯化钠胰胨水 生长旺盛70gL 氯化钠胰胨水 明显生长100gL 氯化钠胰胨水 几乎不生长靛基质 阳性VP 阴性动力 阳性细胞色素

9、氧化酶 阳性赖氨酸脱羧酶 阳性生化鉴别精氨酸双水解酶 阴性42生长 阳性蔗糖 不分解扩大生化鉴别OF 试验 发酵型3.3.4.2.如表 1 生化项目（扩大生化试验项目除外）中，仅有一项生化试验不符合时，按以下步骤做进一步鉴定。3.3.4.2.1.蔗糖分解试验，42生长试验，OF 试验。如仍符合副溶血性弧菌特性，可按第 7 章报告结果，如其中有一项不符合，即可排除。3.3.4.2.2.副溶血性弧菌与有关细菌的鉴别可参考表 2 进行。表 2.副溶血性弧菌与有关细菌鉴别表试 验 副溶血性 弧菌 溶藻胶 弧菌 鳗弧菌 创伤弧菌 河弧菌 麦氏弧菌 嗜水气单 胞菌 类志贺邻 单胞菌TCBS（蓝绿色菌落）

10、42生长 v v 盐耐受性试验（生长）0氯化钠 60gL 氯化钠 80gL 氯化钠 v v 100gL 氯化钠 赖氨酸脱羧酶 v 精氨酸双水解酶 v v 鸟氨酸脱羧酶 v v v蔗糖发酵 v 乳糖发酵 v v v甘露醇发酵 v 阿拉伯糖发酵 v VP 试验 v v 注：空白处表示未试验；v 表示可变的。4.报告结果生化试验符合副溶血性弧菌特性的菌株，按增菌培养阳性管数，应用表3（3 管法），查出每 100g 样品中的副溶血性弧菌 MPN 值。检验结果报告为每100g 样品中副溶血性弧菌的最近似值为个。表 3.每克样品的最近似值（3 管法 MPN）阳 性 管 数 阳 性 管 数0.1 0.01

11、0.001 MPN 0.1 0.01 0.001 MPN0 0 0 3 0 3 1 130 0 1 3 0 3 2 160 0 2 6 0 3 3 190 0 3 9 1 0 0 3.60 1 0 3 1 0 1 7.20 1 1 6.1 1 0 2 110 1 2 9.2 1 0 3 150 1 3 12 1 1 0 7.30 2 0 6.2 1 1 1 110 2 1 9.3 1 1 2 150 2 2 12 1 1 3 190 2 3 16 1 2 0 110 3 0 9.4 1 2 1 151 2 2 20 2 3 1 361 2 3 24 2 3 2 441 3 0 16 2 3 3

12、 531 3 1 20 3 0 0 231 3 2 24 3 0 1 391 3 3 29 3 0 2 642 0 0 9.1 3 0 3 952 0 1 14 3 1 0 432 0 2 20 3 1 1 752 0 3 26 3 1 2 1202 1 0 15 3 1 3 1602 1 1 20 3 2 0 932 1 2 27 3 2 1 1502 1 3 34 3 2 2 2102 2 0 21 3 2 3 2902 2 1 28 3 3 0 2402 2 2 35 3 3 1 4602 2 3 42 3 3 2 11002 3 0 29 3 3 3 1100注：当报告每 100g 样

13、品中副溶血性弧菌的最近似值时，可将查表所得数字乘以 100。5.神奈川现象及血清学实验（根据需要进行）5.1.神奈川现象试验5.1.1.以接种环将 30gL 氯化钠胰胨水培养物点种于充分干燥的我妻氏血琼脂平板上。可先在平板背面以玻璃铅笔划出若干小区，使一个平板能做多个试验。5.1.2.37培养 1824h。5.1.3.在 24h 以内观察结果，阳性结果在菌落周围有一清晰的透明环。5.2.血清学鉴定：副溶血性弧菌的抗原分为 O、K、H 三种。血清学分型以 O 及K 抗原进行鉴定。5.2.1.K 抗原凝集试验5.2.1.1.将经生化试验证实为副溶血性弧菌的菌株转种在两支 30gL 氯化钠普通琼脂斜

14、面上，37培养 18h。5.2.1.2.以 2mL20gL 氯化钠溶液洗下一支琼脂斜面培养物，制成浓厚菌悬液。5.2.1.3.先以 K 多价抗血清与菌悬液进行玻片凝集试验。在 1min 内观察反应。阳性凝集者，另进行自然凝集试验，若自然凝集试验为阴性，再以该 K 多价抗血清中的单因子 K 抗血清进行试验。5.2.1.4.与单因子 K 抗血清出现阳性凝集的，为该菌株的相应 K 抗原。5.2.2.O 抗原凝集试验5.2.2.1.以 20gL 氯化钠含 5（VV）甘油溶液洗另一支琼脂斜面培养物，将菌悬液经 121高压灭菌 1h。5.2.2.2.以离心沉淀法去上清液，再以 20gL 氯化钠溶液 400

15、0rmin 离心15min，洗两次沉淀后加 0.5mL2氯化钠溶液制成浓厚的菌悬液。5.2.2.3.以已知 K 抗原对应的 O 群抗血清进行玻片凝集试验，同时以 20gL 氯化钠溶液代替抗血清做自然凝集对照试验。5.2.2.4.与抗血清出现强阳性凝集的，为该菌株的 O 抗原。5.2.3.根据以上血清学试验结果，可报告为发现副溶血性弧菌 OK血清型。6.培养基及试剂6.1.30gL 氯化钠稀释液氯化钠 30.0蒸馏水 1000mL加热溶解，调至 pH7.0，121高压灭菌 15min，以无菌操作分装于 500mL广口瓶或 500mL 三角瓶，每瓶 450mL 以及 17mm170mm 试管，每管

16、 9mL，做稀释样品用。6.2.60gL 氯化钠蛋白胨水（PW）蛋白胨 10.0g氯化钠 60.0g蒸馏水 1000mL将各成分加热溶解，调至 pH7.2，分装于 17mm170mm 试管，每管10mL。121高压灭菌 15min。6.3.氯化钠多粘菌素 B 肉汤（SPB）酵母浸膏 3.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 20.0g多粘菌素 B 250 单位毫升培养基蒸馏水 1000mL将各成分（除多粘菌素 B 外）加热溶解，稍冷后加入多粘菌素 B，调至pH7.4。分装于 17mm170mm 试管，每管 10mL。121高压灭菌 15min。灭菌后，立即将培养基取出放凉。6.4.硫代硫酸钠、柠檬酸钠

17、、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）酵母浸膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 10.0g柠檬酸钠 10.0g硫代硫酸钠 10.0g胆酸钠（以牛胆酸钠代替） 3.0g牛胆汁粉（以混合胆盐代替） 5.0g蔗糖 20.0g柠檬酸铁 1.0g琼脂 18.0g溴麝香草酚蓝 0.04g麝香草酚蓝 0.04g蒸馏水 1000mL除指示剂外，将各种成分加热溶解，调至 pH8.6，加入指示剂。此培养基不必高压灭菌，煮沸 12min，待培养基稍凉后倾注平板。在该平板上，溶藻胶弧菌为黄色菌落，而副溶血性弧菌为蓝绿色菌落。肠球菌、变形菌及大肠菌群有时也会生长，但其菌落一般较小，易与副溶血性弧菌区别。6.5.氯化钠三糖铁琼脂

18、（TSI）牛肉浸膏 3.0g蛋白胨 20.0g乳糖 10.0g蔗糖 10.0g葡萄糖 1.0g硫酸亚铁 0.5g硫代硫酸钠 0.5g氯化钠 30.0g琼脂 12.0g酚红 0.024g除琼脂和酚红外，将其他成分用蒸馏水 400mL 微火加热溶解，同时将琼脂置于 600mL 蒸馏水中，浸泡数分钟后，加热煮沸使完全溶解。然后将以上两液混合均匀。调至 pH7.4，加入指示剂混匀，分装于 15mm150mm 试管，每管34mL，115高压灭菌 15min。灭菌后摆成斜面，使高层和斜面各约 3cm。6.6.嗜盐性试验用胰胨水（TB）胰胨 40.0g酵母浸膏 12.0g蒸馏水 4000mL完全溶解后，分成

19、 4 份，其中 3 份分别加入 30g、70g、100g 氯化钠，使成0、30gL、70gL、100gL 不同浓度的氯化钠胰胨水。调至 pH7.5。分装15mm150mm 试管，每管 7mL。121高压灭菌 15min。6.7.胰胨大豆琼脂斜面（TSA）胰胨 15.0g植物蛋白胨 5.0g氯化钠 30.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL将各成分加入水中，要不断搅拌，加热至煮沸 1min。分装于 15mm150mm试管，每管 3mL。121高压灭菌 15min 后制成斜面，最终 pH7.30.2。试剂：10gL 盐酸四甲基对苯二胺水溶液10gl 萘酚乙醇溶液将配好后的 10gL 盐酸四甲基

20、对苯二胺溶液置于密塞棕色玻璃瓶中，于510存放。此试剂极易氧化，宜现用现配。试验时，取 37 1824h 的胰胨大豆琼脂斜面培养物 1 支。将两种试剂各 23 滴从斜面上端流下，2min 内呈现蓝色者为细胞色素氧化酶试验阳性。6.8.靛基质试验用培养基（I）培养基同 6.6 的 30gL 氯化钠胰胨水。靛基质试剂柯凡克（KOVAS）氏试剂：对二甲氨基苯甲醛 10.0g纯戊醇 150.0mL浓盐酸 60.0mL将试剂溶于戊醇中，然后慢慢加盐酸。加热至 60后，呈深黄色，静置67h，变成黄色即可使用。试液宜小量配制，冰箱保存。久存后，试液变为黄褐色，不可继续使用。在 30gL 氯化钠胰胨水 182

21、4h 培养液中，滴加柯凡克试液 0.1mL。出现红色环者为阳性，出现黄棕色环者为阴性。6.9.氨基酸试验用培养基6.9.1.赖氨酸脱羧酶培养基（LD）酵母浸膏 3.0g葡萄糖 1.0g氯化钠 30.0gL赖氨酸 5.0g溴甲酚紫 0.016g蒸馏水 1000mL除溴甲酚紫外，将各成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10min，加热至完全溶解，调至 pH6.70.1。分装于 10mm100mm 试管，每管 1mL。121高压灭菌 10min。灭菌后应立即取出放凉，接种培养后，培养基颜色变为深紫色的为阳性反应，变为黄色的，为阴性反应。6.9.2.精氨酸双水解酶试验用培养基（AD）基础培养基同赖氨酸

22、脱羧酶试验用培养基，精氨酸加入量同赖氨酸量。6.10.VP 半固体琼脂（VP）酵母浸膏 1.0g蛋白胨 12.0g葡萄糖 10.0g氯化钠 30.0g琼脂 3.0g蒸馏水 1000mL将各成分加入蒸馏水中，静置约 10min，搅拌、加热至溶解。调pH7.30.1，分装于 10mm100mm 试管，每管 1mL，121高压灭菌 10min。灭菌后，立即取出放凉。VP 试剂：甲液：萘酚 6.0g纯乙醇 100.0mL乙液：氢氧化钾 40.0g肌酸 0.3g蒸馏水 100.0mL先将氢氧化钾溶于水中，再加入肌酸。以上试剂保存于冰箱中，可使用两个月。试验时，分别加甲液 0.2mL（约 6 滴）和乙液

23、0.1mL（约 3 滴）。加入试剂后呈现红色者为阳性，铜色为阴性。对阴性结果 1h 后再做一次检查。6.11.糖类分解试验用培养基蛋白胨 10.g牛肉浸膏 3.0g氯化钠 30.0g溴甲酚紫 0.04g蒸馏水 1000mL除溴甲酚紫外，将各成分加热溶解，按 1量加入糖类。调至pH7.00.2，加入溴甲酚紫。分装于 10mm100mm 试管，每管 1mL，112高压灭菌 15min。6.12.42生长试验用培养基胰胨 17.0g大豆胨 3.0g氯化钠 30.0g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 2.5g蒸馏水 1000mL除葡萄糖外，将各种成分混合溶解，煮沸 12min，加入葡萄糖。调至pH7.30.

24、2。分装于 15mm150mm 试管，每管 7mL，121高压灭菌 15min。6.13.OF 试验用培养基（HLGB）蛋白胨 2.0g酵母浸膏 0.5g氯化钠 30.0g葡萄糖 10.0g溴甲酚紫 0.015g琼脂 3.0g蒸馏水 1000mL将各成分（除溴甲酚紫外）加于蒸馏水中加热溶解，调至 pH7.4，加入溴甲酚紫，混匀，分装于 15mm150mm 试管，每管 3mL，121高压灭菌 15min。本培养基用于鉴别革兰氏阴性细菌对于葡萄糖的发酵型和氧化型代谢作用。将同一菌株接种于 2 支该培养基中，其中一支管的培养基上面加灭菌矿物油脂来隔离氧气，而另一支管不加。这样发酵型细菌在两管培养基中

25、均产生酸性反应，氧化型细菌则在未加矿物油脂的管中产生酸性反应，而在加油脂的培养管中只有轻度或者不生长也无反应变化。6.14.神奈川现象试验用我妻氏琼脂（WA）酵母浸膏 3.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 70.0g磷酸氢二钾 5.0g甘露醇 10.0g结晶紫 0.001g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL调至 pH8.0（不必高压），加热 300min，待冷至 50，按 5的体积轻轻加入事先准备好的以生理盐水洗三次的新鲜人或兔血球。混合均匀倾注平皿，充分干燥后使用。注：新制备的培养基均应用已知阳性及阴性菌进行测试，以保证培养质量。7.来源：SN 017392附 录 A食品中副溶血性弧菌检验程序（补充件）样品 50g450mL 30gL 氯化钠稀释液 均质（8000rmin），1min 60g L 氯化钠蛋白胨水 33 管 氯化钠多粘菌素 B 肉汤 33 管 氯化钠多粘菌素 B 肉汤 硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐蔗糖琼脂平板 无盐胰胨水 30g L 氯化钠胰胨水 氯化钠三糖铁琼脂革兰氏染色镜检 70gL氯化钠胰胨水100gL氯化钠胰胨水细胞色素氧化酶试验靛基质试验赖氨酸脱羧酶试验VP试验精氨酸双水解酶试验如要求一定量样品中不得有副溶血性弧菌，则可将样品接种于 9 倍量的60gL 氯化钠蛋白胨水（前增菌）或多粘菌素 B 肉汤（直接增菌），以下操作按上列程度进行。