1、发酵工程技术实验指导书适用课程：发酵工程技术目录实验一 酵母菌的分离和纯化 .1实验二 果酒制作及酒精度测定 .3实验三 乳酸菌的分离和鉴别 .6实验四 酸奶制作以及感官鉴评 .9实验五 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 .11实验六 发酵型虾酱的生产实验及氨基酸态氮的测定 .131实验一 酵母菌的分离和纯化一、实验目的应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理大多数酵母菌为腐生，其生长最适 pH 为 4.56，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利
2、用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。三、实验材料及试剂1、成熟葡萄或苹果等果皮2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称 200 g 并加蒸馏水 1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至 1000ml，制成 20%的马铃薯汁。（ 2） 在 20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。（3）在 115条件下
3、高压灭菌 20 分种。3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5 、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。 4、0.1%美蓝染液：0.1g 美蓝溶于 100mL 蒸馏水中。5、生理盐水四、主要仪器设备高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml 的无菌吸管、18*180mm 试管、培养皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台 等。五、实验方法2l、接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装 100mL 无菌生理盐水的三角瓶中，充分搅拌后，用无菌移液管吸取 1mL 接入
4、到 9mL 乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置 2830，培养 24 小时。（每组转接 3 支试管）2、加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液 1mL，注入另一管9mL 乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置 2830再培养 24h。3、镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的 0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原，菌体不着色。4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取0.1mL 加富培养液到平板中，涂匀后 2830培养 24h。5
5、、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。 6、 镜检：挑取单菌落，制片观察形态。7、 挑取单个纯菌落，每组转接 3 支斜面试管，备用。六、实验结果的观察及记录时间 观察并记录 试管1 试管2 试管31 第一次接种后 观察试管内培养液的情况观察试管内培养液的情况镜检培养液内菌的形态结构2 加富培养后粗略判断是否为酵母菌3 分离纯化后 观察培养皿内菌落形态七、实验注意事项1、配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸。2、灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一
6、定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。3、接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。3实验二 果酒制作及酒精度测定、实验目的了解果酒酿制原理并掌握苹果酒酿制技术。二、实验原理果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。三、实验材料及试剂
7、41、菌种：已分离纯化的酵母2、药品试剂蔗糖，亚硫酸钠，果胶酶，柠檬酸苹果汁培养基：粗滤新鲜果汁（蔗糖调至 13Be，酸度 0.5%以下）1000ml，K 2HPO4 0.1g，MgSO 47H2O 0.1g，配好后，加热煮沸 35 分钟，静置 10 小时以上，过滤、分装三角瓶和试管，115灭菌 20 分钟。四、仪器设备1mL、10mL 吸管、300mL 三角瓶（发酵缸）、果汁分离器、离心机、接种环、酒精灯、无菌超净台、恒温培养箱、显微镜、电热鼓风干燥箱、糖度计、菜刀、案板、载玻片、盖玻片、电子天平、烧杯、高压蒸汽灭菌锅等。五、实验步骤（一）酒母培养1、菌种活化（一级种）：按无菌操作法取一环酵
8、母菌接种于装有 10mL 灭菌苹果汁培养基的试管中，混匀后置 2830下培养 25 天，镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。2、母发酵剂制备（二级种）：接 12mL 一级种于装有 100mL 苹果汁培养基的三角瓶中，于 28下培养 23 天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。3、生产发酵剂的制备（三级种）：方法与母发酵剂相同，一般采用 300mL的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积 1/23/5 的果汁培养液，灭菌冷却后，按 10接种量接入母发酵剂，在 2528下培养 2448h，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。（二）果酒生产工艺流程如下：5果胶酶、Na 2SO3、柠檬酸苹果分选清
9、洗破碎压榨粗果汁过滤除果楂、苹果酸、丹宁离心6活化酵母母发酵剂生产发酵剂澄清果汁蔗糖发酵除渣后发酵原酒操作要点：1、分选：取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。2、清洗：清水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。3、破碎：为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。用破碎机破碎至果块粒度 0.5cm3 左右，并除去果籽。4、压榨分离：破碎后立即进行压榨分离，分离出的果汁中不得夹带果肉。然后加入 0.10.15g/L 的果胶酶和果汁量 0.02的亚硫酸钠。混合均匀后静置20min。75、离心：转速 3000r/min，离心 10min。6、澄清果汁：用柠檬酸调整总酸含量为 5g/L 左
10、右，蔗糖调整糖度含量为15-23%。总酸度的测定：用移液管吸取澄清果汁 10mL 于 250mL 锥形瓶中，加 50mL 蒸馏水，置电炉上加热至沸，取下待冷却后加入 2 滴酚酞指示剂摇匀，用 0.1mol/L NaOH 标注溶液滴定至终点，记录 NaOH 体积（mL）。结果计算：X=cV0.06405/10.00式中 X总酸含量（以柠檬酸计），g/ml；cNaOH 标准溶液浓度，mol/L；0.06405换算为柠檬酸的系数，即 1mol/L NaOH 相当于柠檬酸的质量，g/mmol；V- 消耗氢氧化钠的体积， mL；10.00样品制备液取用量，mL7、前发酵：取经干热灭菌的 300mL 三角
11、瓶，加入占容积的 45 的澄清果汁，添加 35的酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在 1822之间，最高勿超过 25，发酵应在 712 天内结束。8、后发酵：前发酵结束后，迅速将酒液与沉渣分离，酒汁转入经干热灭菌的三角瓶中，进行后发酵，使残糖继续分解。期间，控制品温在 1822之间，不要超过 25，时间 1 个月，即得原酒。要求残糖含量小于 2gL 以下，总酸（以苹果酸计）大于 5gL。用酒精计测原酒酒度。酒精度的测定方法：取一清洁的 100mL 容量瓶，用被测试样荡洗 23 次。然后注满至近刻度，将容量瓶置于 20水浴中 2030min，用 20试样补足至刻度。将试样移入500mL 蒸馏瓶，用
12、 50mL 冷水分 3 次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。将烧瓶接入蒸馏装置。用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。为防止酒精挥发，在气温较高时蒸馏，应将容量瓶浸入冰水浴中，并使应接管出口伸入容量瓶的球部。当蒸馏液体积达到容量的 9598%时停止蒸馏。用少许水洗涤应接管的头端，洗液并入容量瓶。塞好容量瓶，摇匀。如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。置容量瓶于 20水浴中 30min，并用清洁的洗瓶加同样温度的水至刻度，再次摇匀。用酒精计直接测定蒸馏液酒精度（结果仅要求达到一位小数） 。五、实验结果项目 色泽 气味 糖度 酸度 酒精度8结果六、思考题1、酵母菌酿酒的原理是什么？2、分别阐述 Na2SO3 和果胶酶的作用。实验三 乳酸菌的分离和鉴别一、实验目的了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。
