1、周围环境微生物检测和啤酒酸奶制备一、 实验内容与目的1. 稀释法分离土壤中微生物；2. 观察周围环境中微生物；3. 掌握微生物的分离、纯化；4. 认识微生物存在的普遍性，理解无菌操作原理；5. 了解固定化细胞技术的方法和意义；6. 了解酵母发酵产生啤酒的过程；7. 学习酸奶制作方法；8. 了解纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别。二、 实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀释摇管法(dilution
2、shake culture method)、平板划线分离法（stesak plate method） 。 本次实验采取的是平板划线分离法和稀释涂布平板法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。 （二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼
3、观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。现发酵常采用固定化技术，即：将生物酶或细胞固定在一定的基质上,从而提供酶或细胞的利用效率。采用固定化技术生产啤酒，具有的优势有：固定化细胞能重复使用；发酵后菌体与发酵液易于分离；后处理工艺简单,成本低；可连续发酵,过程自动化。而传统发酵法中，酵母细胞只发酵一次即弃去菌体。固定化技术中的包埋法，即：将微生物细胞均匀的包埋在水不溶性载体的紧密结构中,细胞不易漏出。优势是：制定固定化细胞时,细胞和载体不起任何反应,细胞处于最佳生理状态；固定化细胞有载体为屏障,可避免外界不利因素的影响。三、 实验材料与仪器（一） 周围环境微生物
4、检测1. 菌源：土样 10g；2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 12 个；3. 实验试剂：0.9% 无菌生理盐水，99ml 生理盐水,每瓶加约 20 粒玻璃珠；4. 实验仪器：培养箱、灭菌锅等。（二） 啤酒酸奶制作1. 实验材料：啤酒酵母，酸奶酵母；2. 发酵培养基：100ml 麦芽汁(8%10%)，新鲜酸奶；3. 实验试剂：2.5%海藻酸钠溶液 5ml,灭菌；1.5% CaCl2 50ml,灭菌；0.9% 无菌生理盐水,50ml；4. 实验用具：无菌滴管，无菌玻璃棒，无菌封口膜封好的 100ml 三角瓶。四、 操作步骤（一） 稀释法分离土壤中微生物1. 采土样选择肥沃土壤,去表层土,挖 52
5、0cm 深度的土壤数 10g,装入烧杯,带回实验室。2. 制备土壤稀释液在实验室外选取土样 1.0g，加入烧杯后，加入 99mL 无菌水，配成西施一百倍的土壤稀释液。震荡 5min 成为土壤悬液，即 10-2稀释。再进行精确稀释，稀释 100 倍，制成 10-4土壤稀释液。3. 涂布用无菌吸头，吸取 10-4浓度土壤稀释液 100ul，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃棒涂涂匀。每人做一块平板。4. 土壤微生物培养将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于 320C 温箱中培养 24h；统计所长出的菌落数。5. 菌落计数遇到有较大片菌苔生长时,弃用。若成片菌苔大小不到培养皿的一半,
6、其余一半分布均匀,将此一半计数乘于 2。（二） 观察周围环境中微生物1. 选择培养皿选择先前制备的 4 个培养皿剩下的三个，可每个中划线标示以后培养多个试样，或只培养一个试样。2. 接种微生物至培养基2.1 手指涂抹（用力一致）;2.2 毛巾,旧纸币拖动;2.3 头发压紧;2.4 无菌接种环分别沾一环自来水和河水划线或取 0.1ml 进行涂布；2.5 用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线；2.6 空气中 10min;2.7 酒精灯火焰边打开皿盖 1min；2.8 咳嗽或打喷嚏；2.9 稍稍打开嘴唇压在培养基上;2.10 水杯水、矿泉水、豆浆等涂板观察。3. 培养箱培养倒置 32培养箱里培养 24
7、 小时观察结果。（三） 啤酒发酵1. 菌体培养将培养 24h 的新鲜斜面菌种,接种于三角瓶中培养。2. 细胞固定化在 5mL 海藻酸钠溶液中,加入 2ml 预热至 35oC 的酵母培养液,混合均匀,以无菌滴管吸取混合液,滴管口离液面 5cm 以上,缓慢而稳定滴加到 CaCl2 溶液中, 即可得到直径约 3mm 左右的凝胶珠;全部滴入.钙化 30min。（四） 酸奶发酵选择一杯新鲜的已加入酸奶酵母的鲜奶，标记上自己的名字，放入恒温箱中发酵，在 10 多小时后，进行熟化。为期一天即可喝到鲜美的酸奶。五、 观察实验结果与分析讨论1. 原始实验数据记录与分析（图片）1.1 三个组员的手机外壳菌种培养由
8、培养结果可知：不同人的手机上，细菌的数量存在很大差别。WCS 同学的手机上细菌较多，CZH 同学手机上略微带有少量细菌，YQL 有些手机外壳含细菌较少。1.2 咳嗽呼出气体中细菌培养由培养结果可知：咳嗽出的气体中含有较多的细菌，而且集中分布在正对的气流中，侧向的细菌含量较少。启示：咳嗽时用纸捂住口，可显著减少咳嗽气流中细菌含量，仅挡住正前方也可取得较好的效果。1.3 未烧过的接种棒与接种环由培养结果可知：用接种棒与接种环接种后，未进行火焰灼烧时，接种棒上含有大量的细菌残留，而接种环由于体积较小、较光滑，残留的细菌较少。两者的微生物培养结果具有明显的对照差异。启示：在用接种棒进行接种后，一定要进
9、行火焰灼烧灭菌，否则会残留大量细菌，影响后续操作的实验结果。1.4 豆浆涂布液培养由培养结果可知：培养基上含有大量的细菌，而且呈现出白色与红褐色两种不同的菌落。由于细菌数量较多，较多重叠，无法进行计数，故进行表象分析。出现此结果有两大原因：豆浆中含有大量的细菌，而且种类不一，但是主要为两种细菌。即此豆浆也已被污染；培养基在配制时混入了大量的杂菌。由于红褐色细菌主要在培养皿周边，且分布相较于白色菌落较均匀，故培养基配制或灭菌时引入细菌的可能性较大。1.5 校河水（上）与实验室自来水（下）由培养结果可知：校河中的水含有大量的细菌，由菌落的单一性可知，校河水中一种细菌占主导地位，即使在稀释后，仍然细
10、菌浓度较大，在短暂的培养时间后，已经无法进行计数统计。实验室的自来水中，细菌的含量较少，由于没有进行体积定量，无法进行细菌的浓度计算。启示：自来水净化系统，可显著改善水质质量，减少细菌含量。1.6 土壤稀释液由培养结果可知：稀释了 10000 倍的浅层稀释液中依然细菌的含量庞大，而且种类不一。由于所提供的土壤稀释液中细菌的浓度过高，整个培养基遍布菌落，无法进行细菌计数。启示：浅层土壤中含有大量细菌，在接触后应及时洗手，减少手上细菌含量。1.7 干手指、自来水清洗后手指、酒精擦拭后手指与碰眼镜的手指。由培养结果可知：干燥的手指上细菌的含量最少，干燥的环境抑制了细菌的吸附于滋生，但是含有少量菌落呈
11、现出光亮白色的细菌。用自来水清洗后，细菌总的数量增加，而之前呈现光亮白色的细菌被清洗掉，菌落呈现灰白色的细菌数量庞大。用酒精短暂擦拭的手指上，并没有减少细菌的含量，只是菌落的大小显著减小，证明酒精抑制了细菌的生长，但并没有杀死细菌。碰了眼镜的手指细菌的含量显著增多，且菌落呈现光亮白色的细菌显著增多，证明眼镜上含有的细菌与手指干燥时相似，眼镜具有与手指皮肤相近的细菌生长环境。启示：酒精擦拭消毒时需保证擦拭的时间，否则只抑制了细菌生长，却未能杀死细菌。干燥而具有油性的皮肤与眼镜等橡胶制品具有相似的表面环境，干燥却富有油性，可抑制细菌吸附于生长，但有部分细菌适应于此环境，与潮湿环境中生长旺盛的细菌种
12、类不一样。1.8 不同器件表面的细菌培养观察由培养结果可知，人体骨髓干细胞离心管、黑色钢笔外壳、红色钢笔外壳、U 盘、新的一元纸币、学生卡上都只含有极少量的细菌，而相较而言在脸皮与眼镜上则含有大量的细菌。尤其脸皮上细菌的含量最高。启示：日常生活中勤洗脸以减少脸皮表面的细菌含量很有必要，与婴儿接触时，尽量减少脸部与其直接接触。2. 实验结果讨论浅层土壤中含有大量的细菌；经过净化处理的水，细菌的含量远低于暴露在自然环境中的校河；湿润的皮肤表面易于细菌吸附于滋生，而干燥的皮肤不利于细菌滋生；平时接触的器件中，树脂制成的眼镜上细菌的含量较多；对手进行酒精消毒时，应保证酒精擦拭的时间长度，否则无法达到杀死细菌的效果，只能抑制细菌的生长。
