1、 膜片钳常见问题解答 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？ 答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流 （怎么注射） ，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳制的是 “膜片 ”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离 (怎么分离 )，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。采 用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。随着膜片钳技术的发展，它
2、已经不仅仅局限于 “膜片 ”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。 2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？ 答：离子通道电导的单位是西门子（ Siemens, S），旧称姆欧，即安培 /伏特。常用皮西门子（ pS）， 1pS 10E-12 S， 1,000 pS 1 pA/mV。 3. MultiClamp 700A 中，在放大器和信号器的连接中，放大器的 raw output 是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口 ? scaled output， raw output 有什么区别 ? 答： Raw output 为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波
3、、放大等）， scaled output 为定标输出，输出的信号经过了处理。后者的灵活度大，因此多采用。目前膜片钳放大器多设有 scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的 ANALOG IN 连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用 Raw output 了。若你想记录两个输出，则需要 将Raw output 与数模转换器的另一个 ANALOG IN 连接。 4. 在 Clampex 的 Edit protocol/Wave 中， Step 和 ramp 各有什么适用范围？ 答： Ramp 多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通
4、道的 I-V 曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用 ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用 ramp。 5. 什么是 ramp？有什么作用？ 答：与步阶（ step）不同， ramp 在 pClamp 软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为 “斜坡电压或电流 ”，可用于作通道 I-V 曲线。 6. input resistance 是什么意思？如何测量？ 答：在电生理学中， “input resistance”指 “输入膜电阻（ Rin） ”。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方
5、波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出 Rin。膜电阻（ Rm）与膜输入阻抗 Rin的关系为： Rm 4r2 Rin， r 为细胞半径。 7. 在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、 串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？ 答：在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿 80%），除非它很小而忽略不计。液接电位（一般在 10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可
6、采用 Clampex 软件中的菜单 Tools/ Junction Potential 功能对其测算，然后决定是否需要校正。 8. Decay 是什么意思？和 inactivation 有何区别 ? 答： Decay 是 “衰减 ”之意， inactivation 是 “失活 ”之意，但在文献中经常混用， decay也常常被说成失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。但实际上，两者细分的话还是有区别的。可以将 Inactivation 分为稳态失活与非稳态失活。后者即 Decay，是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（ Steady-state
7、 inactivation）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。 9. 什 么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？ 答：在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活 (Deactivation)，所记录到的电流称为尾电流（ Tail current），主要反映通道的关闭特征。延迟整流性 K+离子通道以及一些不同类型的 Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而获得通道关闭过程的时间常数。 尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。如研究尾电流幅
8、度与脉冲电压的关系、脉冲 电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。 10. 如何理解 steady state activation 中的 steady state 的意义？ 答： “steady state”是 “稳态 ”的意思。一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导 G，作出 G-V 曲线，该曲线称为 稳态激活曲线 ，也就是我们常说的 激活曲线。 11. 电极拉制程序中具体
9、应该如何控制。在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法 . 答：不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于 P-97 拉制仪，只需要设置 Velocity，可不用设定 Pull）与温度。一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于 P-97 拉制仪，温度的设定需要先测量 Ramp 值），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。检查电极还有
10、其它方法，如 “气泡 数法 ”，也可用放大器通过测量电阻来查看。 12. Rm 4r2Rin？似乎 Rin 是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容 Cm 来标化而用这个什么 4r2？细胞形状各异， Cm 是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用 Cm 标化的吗？盼回答，同时希望能将 Rin 的意义再多讲一点，谢谢 答：（ 1）一定要注意不要拘泥于 Rm和 Rin 这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是 Rin。通常我们所说的 “膜电阻 ”是指 “膜输入阻抗 Rin”，但也有人用来指 Rm。（ 2）你可以用 Cm来计算膜面积，实际上这也正是我们的做法，用来估 算细胞大小，用于对通
11、道电流幅度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻 Rm（也称为 “固有膜电阻 ”）。 Rm的计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用 Rm的（虽然符号用 Rm）。（ 3）实际上， Rin 反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻），也时常被称为 “膜电阻 ”（这正是使人们产生混淆的原因！），是膜的被动反应参数之一。所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化），在 离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出Rin。当大量离子通道开放时
12、，膜对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量 Rin，也没有了测量的意义。 13. 请教什么是 Channel availability？ 答： Channel availability 指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。例如，海马神经元 Na 通道的 channel availability可因乙酰胆碱 M 受体的激活而降低，表现为 Na 通道电流幅度的降低。 14. 什 么是 window current， 我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。但是我有一个疑问，比如电压依赖的 T 型钙通道，书上说在 windonw c
13、urrent 的时候有持续性的钙内流，但是 T 性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？怎么会有不失活的电流呢？ 答：如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是 window current，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。 T 性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即 window current，它是一些快速失活通道的动力学特征。对于 T 型钙通道，其 window current 维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的 T 通道其作用不尽相同。 1
14、5. 使用 Clampex 8.0 记录配体门控离子通道电流， protocol 如何设置 ? 答：需要事先在 Lab Bench 中设定好 Channel 序号和 Signal 名称。在 Edit Protocol中选择 Gap-free 模式，采样频率可用 5kHz，选好 Input 和 Output。先在 Clampex中启动记录（ Record），然后诱发电流，可用 Time Tag 作诱发标记。 16. 电极内液中加入 1mmol/L的 EGTA 和 10mmol/L 的 EGTA 有什么区别 ? 答： EGTA 一般用 10 mM 左右（ 1 mM 太低），促进封接，鳌和内钙。 1
15、7. 什么是漏电流，为什么要做 Leak subtraction？ 答：漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处 “漏掉 ”的电流），也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子通道电流时要将它去除。膜片钳放大器与采样 分析软件都具有将其去除的漏减功能。 18. 请问动作电位是否一定要有越过 0 的超射，我在一篇文献中看到作者将一个没有超射的电位变化也称为动作电位，我觉得不对，应该是阈下反应才对吧？但又不敢下结论，觉得国外文献不该出错。 答：一般生理情况下动作电位都含有超射，超射与 Na 离子（或 Ca 离子）的
16、平衡电位有关。但在具体实验中（或某些病理情况下），若细胞内外液的 Na 离子（或 Ca 离子）的浓度发生变化，则 Na 离子（或 Ca 离子）的平衡电位也随之变化，就可能不产生超射或超射值更大 19. 我想请教一下为什么我们用培养的大鼠海马神 经元记录 NMDA 电流，总是会出现电流的衰减，而且我们记录是选择的培养第 10-14 天的大鼠，可是电流大小不等，具体在 100-1500pA 间波动，这让我们很疑惑，注明一下，电极内液中我们用了 CsCl 和 ATP、 GTP。 答：电流大小不等与细胞大小、细胞状态等都有关，另外更重要的可能与你的给药方法有关，不知你采用的是哪种给药方法？正常情况下，
17、连续诱发受体电流会存在失敏，表现为电流的衰减（幅度减小），但如果在记录过程中细胞状态逐渐不好，也会出现这种情况。我们认为你所选用的细胞培龄没有问题，内液也没问题。 20. 脑片 实验中， ACSF的配方中的 Mg离子，有的用的 MgSO4，有的用的 MgCl2，他们有什么区别？有关渗透压，有的配方是 295 mOsm，有的 300 多 mOsm，他们又有什么区别？如何调整 ACSF 的渗透压？ 答：用 MgSO4和用 MgCl2没多大区别，但如果要记录 Cl 电流，就要有所考虑；另外若所需要的 Mg 浓度有大的变化，也要考虑到 Cl 和 SO4离子所可能带来的问题。渗透压有个范围，一般在 290 320 之间都没有问题，精确地测量与调节渗透压需要特殊的渗透压仪，但一般都是通过离子强度进行计算，只要大体在上述范围就行。
