1、结核病细菌学检验的标准化与新诊断技术进展,王甦民2012年4月,强化结核病实验室诊断标准化的必要性,1、全球结核病控制的三大挑战：耐药结核病、HIV/艾滋病合并结核病、移民（流动人口）2、我国结核病疫情依然严重3、目前结核病实验室诊断技术的不足,分类,结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。,结核分枝杆菌特点,结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10-20小时细胞壁厚度为1035nm，较一般细菌的细胞壁厚，含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。抗酸性是分枝杆菌的重要特征。
2、,结核病细菌学检查的重要作用,细菌学检查是结核病最客观、最科学和最重要诊断方法和流行病学研究工具。因此结核病的实验室检验仍然面临着较多的问题。,细菌学检验存在的问题,不易于标准化操作误差较大（可达到30%） 1、个人操作误差 2、标本性状 3、标本来源对结果的理解差异可影响检验结果对临床治疗的参考或指导意义。,主要的细菌学检验技术,1、痰涂片抗酸染色、镜检技术2、分枝杆菌分离培养技术3、分枝杆菌快速培养技术4、药物敏感性实验技术5、分枝杆菌菌种鉴定技术,标准的痰涂片抗酸染色、镜检技术,标本的收集，特别是痰标本的采集、保存制片和染色过程的标准化读片操作的熟练程度和标准化对结果的理解,痰标本的采集
3、、保存和运送,脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰量应为3-5毫升。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。不能及时检验的痰标本应置4C冰箱保存，如需转运，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，放在专用的转运箱内运送。,标本的采集,标本留取方法痰标本的留取应在医护人员的指导下进行。医护人员应告知病人如何咳痰，合格的痰标本是深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，并说明唾液检出的可能性很小。检验人员检查痰标本的性状，并在登记本和检验报告单上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分类登记）。,如何正确留痰,查痰对于结核病
4、的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。 送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下列要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取12口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。正确的咳痰方法： 1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。 2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。 3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。 4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。 5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。* 注意：部分人如果
5、忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。,直接痰涂片检查法,萋尔-尼尔逊氏（ZiehlNeelsen）抗酸染色法 （热染法）,细菌学常规检查 直接涂片法,操作流程,涂痰膜自然干燥,复红加热初染5分钟,自然干燥镜检,流水冲洗,美兰复染30秒,盐酸酒精脱色,流水冲洗,流水冲洗,载玻片,（一）新载玻片必须经95%乙醇脱脂，检查无划痕后 方可使用。（二）一张载玻片只能涂抹1份痰标本。（三）载玻片只允许一次性使用，
6、严禁清洗后重复用于AFB检查。（四）载玻片正面一侧1/3处标注实验室序号(如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。（五）载玻片正面另一侧2/3中央处均匀涂抹成面积为1020 mm的卵圆形痰膜。,染色,（一）严格按照操作规范完成染色程序。（二）染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。（三）将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表明该玻片涂抹过厚，或染色过程有误。（四）染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。,（一）为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触玻片上的痰膜。（二）仔细观察
7、300以上的视野。（三）每个工作日，一名镜检人员的玻片阅读量一般不应超过25张。（四）连续阅读1012张玻片后，应休息20分钟左右。,镜检读片,痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率 检出菌数 每毫升标本估算菌数 阳性结果机率0/100或更多视野 1000 101-2/300视野 5000 - 10000 501-9/100视野 约30000 801-9/10视野 约50000 90（cv）1-9/每视野 约100000 96.2（cv）10或更多/每视野 约500000 99.95（cv）,查痰次数与阳性机率关系为什么诊断前强调三涂两培（3S 2C） 1 2 3 4 5,细菌学常规检查 直接涂片法,
8、显微镜检报告方式：0条/300视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阴性1-8条/300视野：实报菌数3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（+）1-9条/10视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（2+）1-9条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（3+）10条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（4+）,细菌学常规检查 直接涂片法,注意事项：选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分涂片阳性率较高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须加温。,细菌学常规检查 直接涂片法,优点：是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、体液、组
9、织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时可报告结果。,细菌学常规检查 直接涂片法,缺点：敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结果；特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不能区分结核和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。,涂片镜检质量保证系统 室内质控,标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告和登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室的统一标准严格进行操作。复查方式：自查：试验员
10、当日对已查涂片抽样复查。互查：由本实验室其他试验员抽查当日10%涂片。,涂片镜检质量保证系统室间质控,以现场和非现场督导为主要方式。现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就实验室布局、安全防护、污染物处理、涂片染色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片复查。非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原则抽取涂片交实验室复查。,复检玻片样本量,1.样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否真正代表被督导实验室的实际水平。世界卫生组织推荐80%灵敏度、100%特异性（针对阴性玻片）、误差为0的可接受数量以及95%可信限样本量表，可以极大地减少样本量，保证了盲法复检在
11、统计学意义上可以代表被评估实验室的总体水平。,复检样本量计算表,复检样本量计算表说明：,a、玻片阳性率：指所有检测的玻片中阳性玻片的比例（平均阳性率）。b、上一年阴性玻片总数：每年玻片的总数减去全年阳性玻片数。c、抽样时，当上一年阴性玻片数量和玻片阳性率不在选择点，阴性玻片数值采用区间上限，玻片阳性率采用区间下限。,复检结果评价,盲法复检的目的不是为了验证某个病人诊断正确与否,而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了玻片镜检结果存在的误差之外，还包括检查标本的质量（合格标本与不合格标本的比例）、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等,以便采取纠正措施，提高实验室的工作质量。,1.误差分类：分为定性
12、误差和定量误差（1）定性误差包括高假阳性和高假阴性高假阳性（High False Positive HFP）：阴性片被错误地判读为2以上的阳性。高假阴性（High False Negative HFN）：2以上的阳性玻片被错误地判读为阴性。,（2）定量误差包括量化误差、低假阳性和低假阴性量化误差（Quantification Error ，QE）：同一张阳性玻片初检者和复检者阳性判断级别的差异。低假阳性（Low False Positive ，LFP）：阴性玻片被错误地判断为1及以下的阳性。低假阴性（Low False Negative， LFN）：1及以下玻片被错误地判断为阴性。,常见“误差
13、”原因,实验室诊断的新进展,1、扩大开展液体培养和药敏试验2、引入现代分子生物学快速检测技术3、引入现代免疫学快速检测技术,1、现代分子生物学检测主要技术,实时荧光定量PCR环介导等温扩增基因检测 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP)分子线性探针（Hain 技术） (2008WHO推荐)基因芯片技术GeneXpert MTB/RIF 快速诊断技术,（1.1）聚合酶链反应（PCR）,PCR诞生于1985年，由美国 Muliis等发明。PCR是一种根据脱氧核糖核酸（DNA）复制原理而设计的体外DNA或核糖核酸（RNA）扩增方法，由高温变性、
14、低湿退火及适温延伸等反应组成一个周期，经过n个周期后，理论上可以获得2n双链DNA分子，使DNA特定区段大量扩增。此检测技术灵敏度高、特异性强、简便、快速，但也存在假阴性、假阳性、污染等方面的问题，研究人员对其进行了不懈的研究，使该技术不断得到改善，新的PCR及其衍生技术不断建立。,实时荧光定量PCR,实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系加入荧光基团，利用荧光积累能够监控PCR扩增的每一个循环，在靶扩增的同时可获得定量的结果.即在同一个反应体系内完成扩增和扩增产物的检测,从而省去了靶扩增后复杂的定量检测工作。,实时荧光定量PCR,该技术的
15、优势在于其扩增产物的自动和实时检测,减少了常规产物检测步骤,也减少了人工判断结果的主观性，提高了结果的客观性和可比较性。同时工作效率大大提高。研究发现，该方法的特异性和敏感性较普通有所提高。与Southern杂交和酶促化学发光技术检测的灵敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。,（1.2）环介导等温扩增基因检测 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP),检测是连续等温进行的。扩增效率十分高，反应灵敏。采用4条引物，识别6个位点，特异性强。不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。反应不需要开盖，在一管内完成全部检测。利用Bst酶的链置换功能进行反应
16、。加入反转录酶，可以完成的一步法检测。,Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE),LAMP 方法,PURE 方法,等温反应高扩增效率高特异性实验周期短(几乎一个小时),简单去除核酸扩增抑制因子缩短处理时间,Pre-treatment kit,LAMP test,Sample,Lysis,Mixture,Filter,DNA,LAMP 检测,阴性,阳性,不需要离心, 等温, 快速 (整个过程只需一个小时)；DNA与SYBR Green结合现示绿色 ，Bst聚合酶于30分钟到一个小时内可将 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500-100拷贝/毫
17、升）的DNA 或RNA扩增到10微克左右。,LAMP 敏感度,10,100,1000,NC,copies/reaction,模板: 纯化的 TB 基因组DNA反应条件: 67, 40min,LAMP结果分析,仪器特点：1.LAMP检测专用，每隔6秒测定反应产物的浊度2.可以设定相应的反应条件与检测要求3.测定结果可直接输入电脑进行实时分析 4.检测结果（图像等）可以打印5.可同时检测32个样本，联管适用,（1.3）、分子线性探针（Hain 技术）,原理：基于PCR扩增的检测方法。扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果，可以鉴定TB和NTM、鉴定TB复合群、快速检测R
18、IF、INH、EMB、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药性,GenoType 分支杆菌试剂盒系列,GenoType MTBC （来自于培养标本的结核分枝杆菌复合群菌种间的鉴定）GenoType Mycobacteria Direct（来自于病人标本的结核分枝杆菌复合群，非结核分枝杆菌复合群的鉴定）GenoType Mycobacterium CM（来自于培养物的结核分枝杆菌复合群，非结核分枝杆菌的鉴定）GenoType Mycobacterium AS（来自于培养物的其他非结核分枝杆菌的鉴定）GenoType MTBDRplus （结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药性检测）GenoType MTBDRsl
19、（结核分枝杆菌乙胺丁醇、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药性检测）,技术设备,TwinCubator 手工杂交仪,自动操作-全自动杂交仪,GT-Blot48 或 GT-Blot 20,GenoType MTBDRplus结果,MTBC及其对利福平和/或异烟肼的耐药性,适用于培养物和痰液。 检测快速，对于直接采集的样本或阳性培养物在数小时后内即可完成检测； 检测INH单耐药型TB、MDR和XDR； 符合WHO推荐的线性探针分析标准。,GenoType MTBDRplus/sl 优点,验证数据,结论,DNA-Strip技术系列涵盖了分枝杆菌菌种鉴定、TB-复合群的区分和药敏试验。所有检测都采用通用试剂盒和相
20、同的方案进行扩增和杂交。 所有检测均可在4-5小时内完成。本法适用于大样本量的检测（每天检测数百份样品）。,（1.4）、基因芯片技术,科学的发展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析 鉴于基因芯片的多种用途和其远大的发展前景，不少生命科学研究机构和生物技术公司都先后参与了这项技术的研究。据不完全统计目前仅国内就有十多家单位从事该技术的研究与开发工作，全世界估计至少有二三十家。它已象半导体技术一样成为一个重要的产业方向。当前已正被广泛地应用于诸多领域，包括生物医学、临床诊断学和基因组学研究。,什么是基因芯片,基因芯片指对数以千记的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和mRNA
21、表达谱的检测等（Trends in Biotechnology)。 该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。,基因芯片技术的主要特点,技术操作简单 自动化程高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本相对低,博奥 分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法),主要分为样品制备、芯片反应和结果判读三部分。首先，将检测菌的DNA从培养、分离纯化的菌株或者直接从临床样品中提取出来；然后，对样品中的靶基因进行扩增和荧光标记；接着，将扩增并荧光标记的基因序列与芯片上的探针进行杂交反应；最后芯片扫描成像，用配套软
22、件进行判读。,芯片扫描结果 1,临床验证,（1.5）GeneXpert MTB/RIF快速诊断技术,Cepheid MTB/RIF: 可直接检测痰液，检测结核分支杆菌的同时，鉴定是否有利福平耐药性， 2小时出结果。GeneXpert检测平台采用实时荧光定量PCR检测原理。所有检测均无需提取核酸，手工操作时间不超过2分钟。,GeneXpert 最大程度简化TB检测！,将痰液加入处理瓶，放置15分钟；将处理后的样品加入样品反应盒；将该盒子放置在GeneXpert中，轻松按下“开始”键；得到结果（2小时）：检测是否含有结核分支杆菌的同时，可对利福平耐药性进行判读。,Xpert MTB/RIF检测操作
23、步骤,1、痰液加入处理瓶， 放置15分钟。2、取处理后的痰液 2mL加入Xpert反应 试剂盒3、将反应试剂盒放入 GeneXpert仪器， 点击“开始”（手工操作至此结束！）4、自动过滤洗涤样品5、自动超声破碎，纯化 样品6、荧光定量PCR扩增7、巢氏PCR扩增8、自动结果判读 （MTB/RIF）,“Sample in. Answer out.”,全自动操作 完全封闭系统 污染可能性小 减少人为错误 结果精确度高 检测时间短,无需专业技术人员和特殊实验室,研究人数 1,700 Patients 秘鲁、南非、阿塞拜疆、印度, 涂片阳性样品： 灵敏性98.2%,特异性99.2% 涂片阴性, 培养
24、阳性样品： 三次检测灵敏性 90.2% 一次检测灵敏性72.5% 对利福平耐药性检测： 灵敏性97.6%,特异性98.1%,结论,GeneXpert检测Mtb简单、易于操作，对操作者技术要求不高：只需要把痰液、反应液加入仪器即可得出诊断报告；GeneXpert检测Mtb快速：整个过程大约2小时。GeneXpert检测Mtb对操作人员安全：整个检测过程全封闭、一次性完成。高灵敏性：BCG176 cfu/ml；H57Rv112 cfu/ml耐药性诊断：可对利福平耐药性进行检测,现代免疫学诊断技术,1、体液免疫诊断技术：是利用结核分枝杆菌或其提取物抗原检测结核病患者血清抗体的方法。目前，通过检测抗结
25、核杆菌的抗体(IgG)诊断结核病的商品化试剂盒已较多。采用的方法包括：酶联免疫吸附试验（ELISA)和免疫金标记技术的免疫层析法和胶体金标记的渗滤法等，采用的抗原也各不相同。,体液免疫学诊断技术的意义,在国内应用较广泛，是结核病的辅助诊断方法之一,尤其对肺外结核、菌阴肺结核的诊断具有应用价值。不足之处：单独使用时，其检测的特异性和灵敏度都有些缺点。目前国际上反对使用该项技术的呼声在增加。原因主要是特异性问题。,2、细胞免疫学诊断技术,细胞免疫诊断技术应用较少，过去主要应用PPD皮试技术，近年来英国和澳大利亚研制了ELISpot 、T-Spot技术和 QFT-Gold 。此项技术用于感染情况的检
26、测是一项特异性较强、灵敏度较高很有希望的新技术。,酶联免疫斑点(ELISpot)技术 是检测细胞分泌细胞因子的一种实验方法，采用可定量的夹心ELISA方法，利用结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6 & CFP-10刺激和激活免疫活性细胞使其产生IFN-，并检测IFN-的浓度变化进行诊断的方法。通过ELISpot酶联斑点分析系统对加底物后形成的斑点分析后得出结果。ELISpot具有较高的特异性和敏感性。,ELISPOT技术原理,细胞免疫主要由T淋巴细胞发动，T淋巴细胞分成效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞。记忆T淋巴细胞在首次感染病原体后长期存在免疫系统中。当再次受到感染刺激后。这些记忆T淋巴细胞发出
27、信号分子并增殖成为效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞分泌细胞因子，如 干扰素(INF- )。所以无论是否有临床症状，检测效应T淋巴细胞在血中的水平可作为机体是否被感染的指标。,ELISPOT在结核病诊断中的应用,在MTB潜伏感染诊断中的应用早期诊断MTB潜伏感染对控制结核病意义重大。目前诊断MTB潜伏感染仍沿用100年来使用的 TST，但 TST不能区分MTB感染患者和接种BCG的健康人以及感染环境中的分枝杆菌患者。Lalvani在土耳其检查了暴露于肺结核家庭环境中的908名健康儿童。皮试结果表明580名儿童患有潜伏性肺结核,需要进行药物治疗,以免转化为活动性肺结核;而ELISPOT结果发现只有3
28、80名儿童患有潜伏性肺结核。通过ELISPOT检测,只需要治疗380名儿童,而不是580名,但却能够预防同样数量的活动性肺结核病例发生。因此，ELISPOT 比TST筛选结核潜伏感染更有效,而且ELISPOT检测结果与MTB的接触程度相关性更强。,ELISPOT早期技术评估 英国Ewer等用ELISpot检测对结核分枝杆菌分泌的抗原有特异性反应的T淋巴细胞来诊断早期结核病。这项研究共纳入了结核流行区有不同程度结核病接触史的535名学生，结果显示结核菌素皮肤试验(TST)和ELISpot的一致性达89%(P0.0001)。但ELISpot与研究对象结核病接触程度之间的正相关性显著强于TST。在接
29、种过BCG的儿童中，TST假阳性的可能性较大，而BCG接种对ELISpot结果没有影响。作者认为ELISpot可开始替代TST，这将使更多的人能在感染仍处于隐匿期时就可进行预防，而不至于发展成为严重的结核病。,ELISPOT法的优点,(1)灵敏、特异，能从100万个细胞中测出1个分泌INF细胞；只有MTB和少数非结核分枝杆菌才会出现阳性反应，而BCG及多数非结核分枝杆菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能区别BCG接种出现的阳性反应。 (2)快速：能早期诊断结核感染，检测全过程2天。 (3)应用面广：在肺结核、肺外结核及免疫抑制的结核患者均能检测。 (4)疗效评估：当结核菌被消灭后，效应T淋巴细胞即消失，测定效应T淋巴细胞也可检测机体是否清除了结核菌，进行临床疗效评估 。,ELISPOT技术的缺点,细胞培养及抗原刺激时,有发生细菌污染的可能,以致实验失败; 实验过程步骤较多,实验人员需有一定的理论基础并经多次操作的培训方能胜任; 目前试剂价格比较昂贵。,结束语,结核病准确、快速的诊断是结核病防治人员多年期盼的。随着科技不断进步，今天企盼已经成为可能。经过不断的对现有技术的优化和继续努力开发更新的技术，相信未来的结核病实验室诊断，一定可以最大限度的满足临床和防治工作的需要。,谢谢！,
