1、菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析广州大学生命科学学院洪韬文生物工程 1121114200044摘要：本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法） ，测出的 OD 值计算出酶活性数值， 接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。关键字：过氧化物酶 蛋白质 OD 值 同工酶 凝胶电泳 前言：本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握
2、的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。参与植物 POD 血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。POD 是一种 氧 化 还 原 酶 ，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD 广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。材料和方法：材料：菜叶，菜花方法：1.植物 POD 的提取分别称取菜心的花和叶各 12 克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入
3、离心管中进行离心，离心条件为 8500rpm，时间为15 分钟。离心完毕后取上清液，并定容至 10ml（刻度试管） ，*此液即为 POD 提取液，取 5ml 冷冻保存，作为电泳的 POD 样品。2.蛋白浓度的测定考马斯亮蓝法标准曲线的制定制作标准曲线回归方程：Y(含量 )=aX(OD595 值) + b， 得出相关系数 R2。3.样品蛋白浓度的测定根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。4.过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）备好酶液，将分光光度计调到 470nm，取光径 1 厘米的比色杯 2 只，向对照杯加反应混合液 2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。而样品管加入反
4、应混合液 2.0 ml，酶提取液 0.5ml，立即计时，30 秒或 1 分钟计 1 次，共计 3 分钟。最后通过测出来的 OD 值计算酶活力。酶活力的计算公式为 每分钟 OD 变化值酶活性（470/min mg 蛋白）-mg 蛋白（或鲜重）5.过氧化物酶同工酶电泳冰箱中拿出粗酶样品，正确安装电泳槽（二块玻璃、一把梳子，二个隔条） ，洗净、擦干，用胶带封好面，夹好。之后制作 PAGE 胶：每张胶 20ml ，由 A、B、C 及水四成份组成，比例为：A:B:C:水2.5 ml: 5ml:1ml: 11.5 ml;配好后，迅速注灌胶，之后插入梳子（一半深度） ，等待 20-30min 凝胶凝固后，去
5、胶带，清洗碎胶，轻轻拨出梳子。安装电泳的样品：将制的胶安装到电泳槽，凹面朝内，再用四个夹子固定，将缓冲液（需稀释 10 倍）加入到电极上下槽。上样：酶样品与含溴酚蓝的 50%蔗糖液混匀，比例为 1 ml 酶+1ml 溴酚蓝蔗糖液；上样量是厚胶（厚梳子）每孔 40 微升，薄胶（薄梳子）每孔 20 微升；电泳：200V，1.5-2 小时，取出凝胶；染色：凝胶置于大培养皿染色，至斑带淡淡出现，马上停止染色；漂洗：脱色液少量多次，脱出背景，然后用水漂洗；最后照好照片。实验结果分析和讨论：数据：蛋白质浓度 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 OD595 值 0 0.151 0.276 0.402 0
6、.517 0.641对照组 菜叶 菜花 (样品稀释 10 倍)0D595 值 0 0.237 0.348Y 菜叶=0.3514Y 菜花=0.5265酶活性叶 0.083 0.156 0.221 0.281 0.339 0.389花 0.077 0.138 0.205 0.252 0.301 0.339质量 叶:2.27g 花:1.92g每分钟 OD 变化值叶 0.073 0.065 0.06 0.058 0.05花 0.061 0.067 0.047 0.049 0.038酶活力（470/min mg 蛋白）菜花酶活性 0.413 0.367 0.339 0.328 0.283 菜叶酶活性 0.457 0.502 0.352 0.367 0.285分析和讨论：整个实验下来，遵从实验步骤，在做这个实验之前有好好的预习，所以没有犯什么错误，并且最终得出的结果比较准确。而误差应该是在用移液枪的时候，在管里面有气泡导致了一系列的数据不准确。而由于因为电泳槽出了些问题，导致电泳的时间不够，导致电泳出来的效果线没有这么下。参考文献：基础生物化学实验生物化学简明教程百度百科-POD百度百科-同工酶致谢：赖梓豪，黎焯南
